S型与R型人参皂苷Rh_2对人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响

　　S型与R型人参皂苷Rh_2对人肺腺癌A549

　　细胞增殖和凋亡的影响

　　张春晶 于海涛 侯金才

　　(齐齐哈尔医学院 神武化学与分子生物学教研室 生物遗传教研室，黑龙江 齐齐哈尔 162042)

　　【摘要】

　　目的：探讨人参皂苷Rh2(S型与R型)对人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响，以阐述人参活性成分抗肿瘤活性的购效关系及可能机制。

　　方法：采用MTT实验测定细胞增殖：碘化丙啶(PI)单染流式细胞仪分析细胞周期中各时期的细胞百分数，观察人参皂苷Rh2对人肺腺癌A549细胞增殖周期的影响。Annexin V-PI双染流式细胞术检测细胞凋亡，采用免疫荧光实验对作为细胞凋亡标志的Caspase-3活性进行测定。

　　结果：人参皂苷Rh2对人肺癌A549细胞毒活性明显存在购效关系，其中25mg·L-1 的20(R)-人参皂苷Rh2和20(S)-人参皂苷Rh2作用48h对肿瘤细胞株A549的增殖抑制率分别为28.5%，33.6%，IC50值分别为33.5,28.5·L-1 。20mg·L-1的20(S)-人参皂苷Rh2作用A549细胞24h后G0/G1期细胞比例显著高于对照组(P<0.01)，S期细胞比例显著地狱对照组(P<0.01)，G2/M期细胞比例与对照组比较无显著性差异，说明20(S)-人参皂苷Rh2能阻滞细胞周期与G1期。30mg· L-1 的S型和R型人参皂苷Rh2作用A549细胞24h后，无论是早起还是晚期凋亡率均明显高于正常组细胞(P<0.05)，并且20(S)-人参皂苷Rh2组早期凋亡率明显高于20(R)-人参皂苷Rh2组，表现出明显的购效效应(P<0.05)。20(R)-人参皂苷Rh2和20(S)-人参皂苷Rh2作用6h的A549细胞中标记Caspase-活性的荧光亮度明显增强，说明Caspase-3的激活参与了人参皂苷Rh2诱导的A549细胞凋亡。结论：S型和R型人参皂苷Rh2人参皂苷Rh2均可剂量依赖性地抑制A549细胞增殖，并且20(S)-人参皂苷Rh2的抗肿瘤活性明显强于20(R)-人参皂苷Rh2，阻滞细胞周期于G1期，具有购效效应：S型和R型人参皂苷Rh2均具有促进A549细胞凋亡作用，并且20(S)-人参皂苷Rh2组早起凋亡率明显高于20(R)-人参皂苷Rh2组，具有购效效应。

　　【关键词】 人参皂苷Rh2;人肺腺癌A549细胞;细胞周期;凋亡

　　肺癌是一种严重影响人类生命健康的疾病之一，目前已成为世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。目前，肺癌病因及发病机制尚未完全阐明，但从肿瘤细胞学来看，肺癌发生的本质在于细胞增殖与凋亡的调节失控。近年来中药的抗癌机制研究取得了很大的进展，尤其对肺癌细胞增殖周期的调控与诱导细胞凋亡两方面内容。积极寻找特效和低毒的肿瘤防止药物成为当今我国乃至世界面临的紧迫任务之一。

　　尽10多年来，有关人参皂苷Rh2抗肿瘤活性的研究取得了很大的发展。体内及体外抗肿瘤研究表明，具肿瘤细胞毒活性的人参皂苷多为一些人参次苷及苷元，人参次苷及苷元的抗肿瘤临床价值已引起人们高度重视。人参皂苷Rh2(ginsenoside-Rh2,G-Rh2或Rh2)有C20位立体构型(S/R)，20(S)-人参皂苷Rh2具有非器官特异性的光谱抗肿瘤作用，由于不同的肿瘤细胞具有不同的遗传背景，人参皂苷Rh2对不同的肿瘤细胞通过不同机制发挥作用。但人参皂苷Rh2影响人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡作用的购效关系评价，国内外尚未见报道，他们对肺癌细胞的作用靶点以及用于治疗肺癌的研究国内外报道甚少。本实验以人肺腺癌A549细胞为模型，对人参皂苷Rh2(S型与R型)的人肺腺癌A549细胞毒活性进行评价，探讨人参皂苷Rh2(S型与R型)对人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响，以阐述人参活性成分抗肿瘤活性的购效关系及可能机制。

　　1. 材料

　　1.1 药物和制剂

　　20(S)-人参皂苷Rh2，即20(S)-原人参二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和20(R)-人参皂苷Rh2，即20(R)-原人参二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷购自中药药品生物制品鉴定所，本室提纯。A549细胞购自中国协和医科大学基础医学细胞中心。优质胎牛血清(Hyclone,美国)，DMEM干粉(Gibco,美国)，0.25%胰酶-0.02%EDTA(吉诺生物医药技术有限公司)，噻唑蓝(MTT)、细胞周期检测试剂盒(中国上海贝博生物有限公司)，AnnexinV-PI双染试剂盒(普利莱公司)，兔抗Cleaves Caspase-3(Cell signal公司)，荧光Cy30标记二抗(康为试剂)，DAPI(Roche公司)。

　　1.2 仪器

　　IX81倒置荧光显微镜(Olympus);FACS420流式细胞仪(COULTER EPICS® XL，美国Becton公司)。

　　2 方法

　　2.1 细胞常规培养

　　A549细胞培养于含10%胎牛血清、1%青霉素和链霉素的DMEM培养基中，培养条件为37℃，5%CO2。用0.25%胰酶-0.02%EDTA消化，传代，取增殖旺盛、状态良好的细胞用于试验研究。

　　2.2 MTT法检测肺癌细胞增殖

　　消化收集对数生长期细胞，并调整成密度为1.5×104个/mL的单细胞悬液，接种于96孔板，每孔100μL，培养18-24h。加入含有不同浓度人参活性成分的DMEM培养液100μL，使终浓度分别为12.5,25,50,10025mg·L-1 ，实验同时设阴性对照组和空白对照组。阴性对照组为加有DMSO的DMEM完全培养液，每组6复孔，培养48h，每孔加入5g·L-1 的MTT100μL，继续培养4h后，弃液，每孔加入DMSO150 μL，振荡器上轻摇10min。用空白调零，自动酶标仪在570nm波长处测出细胞对照组和各实验组的吸光度A，以每组6个孔的平均值作为各组的平均A，本实验重复3次。计算各实验组的抑制率=1-A实验组/A对照组 ×100%，比较各个试验组在不同相点对A549细胞的抑制率。采用SPSS10.10统计分析软件，应用直线回归法计算IC50值。

　　2.3 PI染色流式细胞分析细胞周期分布

　　取对数生长期A549细胞，以密度为1×105个/mL接种于6孔板内。换成0.5%血清的DMEM，37℃继续孵育12h，使细胞进入静止期。弃上清，实验分组：细胞对照组、DMSO助溶剂对照组和人参皂苷Rh2(S型或R型)组，培养24h后，收集培养的细胞1500r·min-1离心8min，悬浮于4℃预冷的200μPBS中，缓慢加入预冷的纯乙醇600μL(700%)，悬浮固定细胞，4℃过夜。检测前用磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次。每一样本中加入100μL RNase 37℃中孵育15min。再加入200μL碘化丙啶，室温下避光5min。利用流式细胞仪分析细胞周期中各时期的细胞百分数。

　　2.4 Annexin V-PI 双染流式细胞术检测细胞凋亡

　　取对数生长期A549细胞，以密度为1×105个/mL接种于6孔板内，每孔2ml。37℃，5%CO2培养箱中培养24h。换成0.5%血清的DMEM，37℃继续孵育12h，使细胞进入静止期。弃上清，实验分组：细胞对照组、DMSO助溶剂对照组和G-Rh2(S型或R型)组，培养24h后，收集培养的细胞。细胞染色：加入500μL的Binding Buffer 悬浮细胞，加入4μL AnnexinV/FITC混匀后，加入5μL Propidium lodide,混匀。室温避光反映15min，流式细胞仪上机分析。流式细胞仪检测，采用15mW氩离子激光，激发光波长为488nm，发射波长为530nm，CELLQuest软件自动获取每样品1×104个细胞。流式细胞仪定量分析，计算annexin V-FITC 及PI双染阳性细胞百分含量。

　　2.5 免疫荧光实验检测Caspase-3活性

　　取对数生长期A549细胞，以密度为1×105个/ml接种于24孔板内，500μL/孔。37℃，5%CO2培养箱中培养18-24h。弃上清，实验分组同上，每组3个复皿。培养6h后，24孔板中A549细胞弃培养基，1×PBS缓冲液冲洗3遍，24孔板中A549细胞用含95%的乙醇固定10min，预冷的PBS洗后放摇床上慢摇5min。加入含0.1%TritonX-100的PBS穿透液，摇床慢摇10min。PBS洗后室温慢摇5min×3次。Cleaved caspase家族蛋白抗体用PBST 1：200 稀释，4℃过夜，PBS洗5min×3次，慢摇。荧光Cy3标记二抗用PBS 1：200稀释，室温45min;PBST洗5min×5次，慢摇。1：500DAPI室温复染5min，封片并拍照。

　　2.6 统计学处理

　　剂量资料的数据用X(-)±s表示，次啊用SPSS11.5软件进行统计处理，组间差异采用t检验进行处理，P<0.05表示差异具有统计学意义。

　　3 结果

　　3.1 人参皂苷Rh2对A549细胞增殖的抑制作用

　　助溶剂DMSO阴性对照组A570与A549细胞对照组相比我明显改变。S型和R型-Rh2各剂量组与对照组相比，A570均明显下降(P<0.05)。25mg·L-1 的20(R)-Rh2和20(S)-Rh2作用48h对肿瘤细胞株A549的增殖抑制率分别为28.5%，33.6%，IC50分别为33.4,28.5mg·L-1 ，说明人参皂苷Rh2具有抑制A549细胞增殖的作用，并且该抑制作用呈剂量依赖性。(图1)。

　　3.2 人参皂苷Rh2对A549细胞周期的阻滞作用

　　20mg·L-1 的20(S)-Rh2作用24h可影响A549细胞周期各时相的分布，G0/G1期细胞比例(78.2%)显著高于对照组(64.2%)(P<0.05)，G2/M期细胞比例(8.7%)与对照组(11.5%)比较无显著性差异。而20mg·L-1 的20(R)-Rh2组A549 G0/G1期细胞比例67%，S期细胞比例22.6%，G2/M期细胞比例10.4%，均与对照组比较无显著性差异。比较C-20位各异构体的抗肿瘤活性，可以看出，20(S)-Rh2能阻滞细胞周期于G1期。(表1)

　　3.3 人参皂苷Rh2促进A549细胞凋亡的作用

　　流式细胞分析仪检测结果显示，30mg·L-1 的20(R)-Rh2和20(S)-Rh2作用24h均可明显促进细胞凋亡，且S型效果显著。定量分析结果表明(表2)，S型和R型人参皂苷Rh2组无论是早期还是晚期凋亡率均明显高于正常组细胞(P<0.01)，并且20(S)-Rh2组早期凋亡率明显高于20(R)-Rh2组(P<0.05)，说明人参皂苷Rh2具有促进A549细胞凋亡的作用，并且具有构效效应。

　　3.4 倒置荧光显微镜下观察Caspase-3活性

　　30mg·L-1 的20(R)-Rh2和20(S)-Rh2作用6h的细胞中标记Caspase-3活性的荧光亮度明显增强。说明Caspase-3的激活参与了Rh2诱导的A549细胞凋亡。(图2)。

　　4 讨论

　　肿瘤的产生是丧失细胞只能调控的结果。生长信号的异常和细胞周期调控的异常将导致细胞增殖的异常，最终产生恶性克隆。研究进展表明，肿瘤共性的生物学特征是失控性生长，其主要分子机制是细胞周期紊乱导致细胞增殖过多和凋亡过少。因此，可以说肿瘤是细胞失控性生长所致的一类细胞周期性疾病。细胞周期调控的信号转导途径及其反馈环路上的一系列调节基因组成复杂的网络精确地调控细胞周期。肿瘤细胞的特征之一，也是抗肿瘤药物的基本要求。另外，肿瘤细胞在不同程度上缺乏成熟的形态和完整的功能，丧失某些终末分化细胞的性状，并常对正常的分化调节机制缺乏重视，认为正常细胞通过增殖和凋亡来维持自身稳定，若两者失衡，则可导致肿瘤发生，因此诱导肿瘤细胞凋亡也是抗肿瘤的一种中药机制。

　　到目前为止，已发现的具有肿瘤细胞毒活性的人参皂苷均为人参次苷和苷元，并且抗肿瘤活性与化合物结果存在很大的关系。在抗肿瘤方面，20(S)-人参皂苷Rh2、化合物CK和20(S)-原人参二醇等人参次苷及苷元表现出明显的构效关系。

　　研究表明，20(S)-人参皂苷Rh2的抗肿瘤作用与阻滞细胞周期有关，但其阻滞细胞周期的机制在不同的报道以及不同的细胞系中所得到的结果不尽相同。多种和G1期相关的细胞周期调节蛋白被Rh2所调节，结果导致Rh2诱导的G1期细胞生长受到阻滞，最终导致细胞发生凋亡。在对人肺癌多种G1期相关的细胞周期调节蛋白如Cyclin-D1，Cyclin-E，CDK6和pRb，导致G1期生长阻滞。而DR4死亡受体的上调在Rh2诱导的A549凋亡中扮演了关键的角色，最终通过Xaspase-8/Caspase-3外源性凋亡通路发生细胞凋亡，而Bcl-2家族分子的水平却没有变化。周东波等却报道人参单体Rh2可通过上调P53和Fas及下调Bcl-2的表达、通过Fas/FasL系统途径诱导人肺腺癌A549/DDP细胞凋亡。不同的机制都表明，G-Rh2可以通过影响细胞周期蛋白(Cyclin)和周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK)的表达调控G 1/S期阻滞点，引发G1期阻滞带。

　　本实验的预试验结果表明，没有转化的5个人参皂苷Rb1，Rb3，Rg1，Re和Rd对A549毒活性较弱，其IC50值均大于100mg·L-1 ，这和文献报道的鲜人参提取物没有抗肿瘤活性项一致。人参皂苷经降解后生成的人参次苷表现出明显的抗肿瘤活性，其中25mg·L-1 的20(R)-人参皂苷Rh2及20(S)-人参皂苷Rh2对肿瘤细胞株A549的增殖抑制率分别为28.5%，33.6%，IC50分别为33.4,28.5mg·L-1 ，可以看出，20(S)-Rh2抗肿瘤活性较优于20(R)-人参皂苷Rh2。本研究结果还显示20(S)-人参皂苷Rh2具有引发G1期阻滞而抑制人肺腺癌A549细胞增殖及诱导凋亡的作用：20mg·L-1 的20(S)-人参皂苷Rh2作用24h可影响A549细胞周期各时相的分布，G0/G1期细胞比例(78.2%)显著高于对照组(64.2%)(P<0.05)，而20mg·L-1 的的20(R)-人参皂苷Rh2组A549细胞G0/G1期细胞比例67%，与对照组比较无显著性差异。30mg·L-1 S型和R型人参皂苷Rh2作用24h后，定量分析结果表明，S型和R型人参皂苷Rh2人参皂苷Rh2组无论是早起还是晚期凋亡率均明显高于20(R)-人参皂苷Rh2组，表现出明显的构效效应，并且20(R)-人参皂苷Rh2和20(S)-人参皂苷Rh2作用6h的A549细胞凋亡。本实验结果与已有报道相一致。但不同构型的人参皂苷Rh2究竟通过何种细胞信号转导通路干预肿瘤细胞增殖和凋亡，不同构效的人参次苷对MAPK/CDK信号通路介导的肿瘤细胞增殖和凋亡的影响与其上游和下游信号传递过程有何关系，需要进一步深入研究。