人参皂苷单体Rh2诱导小鼠前胃癌细胞系凋亡的分子机制

　　人参皂苷单体Rh2诱导小鼠前胃癌细胞系凋亡的分子机制

　　吴歌，杨世杰

　　吴歌.杨世杰，吉林大学基础医学院药理学教研室吉林省长春市130021

　　吴歌 在读博士研究生 主要从事肿瘤分子药理学的研究

　　Molecular m echanism of G-Rh2-induced apoptosis in gastric carcinom a cells GeWu，Shi-.1ieYang

　　Ge Wu，Shi—Jie Yang，Department of Pharmacology，School of Basic Medical Sciences.Jilin University,Chang—chun 1 3002 1，Jilin Province，China

　　Correspondence to：Shi—Jie Yang.Department of Pharma—cologY，School of Basic M edical Sciences.Jilin University.Changchun I 3002 1，Jilin Province.

　   Abstract

　　AI M：To investigate the effect of Ginseng(G). Rh2 on the proliferation and apoptosis of mouse gastric carcinoma cells(MFCs)，and to explore the activation of the Ca transduction pathways mediating G.Rh2-induced M FC cell apoptosis.

　　METHODS：M FCs were divided into a norm al free—serum MFC cell group，a G—Rh2 f3，10，30mg/L)treatment group，a Ca chelator BAPTA　(20~tmo1)+G—Rh2(10 mg/L)group and a BAP—TA(20~tmo1)group.Morphologic changes were observed by fluorescence microscopy(Hoechst 33 2581.The early apoptosis rate was detected by Annexin V.FITC using flow cytometry;late apoptosis was analyzed by agarose gel electro—phoresis.The m itochondrial m em brane poten. tial fAWm1 and Ca densitv were measured by confocal m icroscopy.The expression of caspase 3 was observed by W estern blotting.

　　RESULTS：G—Rh2(10 mg/L)reinforced cell activity and induced apoptosis of M FC cells.The apoptosis rate in the drug gr oup increased gr eatly after G—Rh2 treatm ent.G—Rh2 induced M FC cell apoptosis，m arkedly enhance calciumion concentration,effectively reduced AWm an d in—creased the protein expression of caspase 3，but al1 of these effects could be inhibited by BAPTA(20~tmo1).

　　CONC LUSION：G—Rh2 can induce apoptosis of gastric carcinoma cells，possibly via a Ca —de—pendent mi tochondrial apoptosis pathway.

　　Key Words：Ginseng Rh2;Apoptosis;Gastric carci—noma;Flow cytometw;Western blotting Wu G，Yang SI.Molecular mechanism of G—Rh2-induced apoptosis in gastric carcinoma cells.Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2007;15(28)：2972—2976

　　摘要

　　目的：观察人参皂苷Rh (G.Rh )诱导小鼠前胃癌MFc细胞的凋亡，探讨ca 在G.Rh 诱导细胞凋亡中的作用，揭示G.Rh 诱导MFC细胞凋亡的分子机制.

　　方法：分别对无血清培养24 h后的MFCf-常细胞组、G.Rh，f3、10、30 mg/L)给药组、Ca 螯合剂BAPTA(20 Bmo1)+G.Rh，(1 0 mg/L)给药组及BAPTA(20~tmo1)组，荧光显微镜(Hoechst 33 258)~察细胞形态学改变;流式细胞仪Annexin V-FITC双染法检测细胞早期凋亡率 琼脂糖凝胶电泳法观察细胞晚期凋亡;共聚焦显微镜分析G.Rh，给药后细胞内钙和细胞线粒体膜电位，Western blot分析caspase 3的表达.

　　结果：10 mg/L@G.Rh 能显著抑制无血清培养的MFC细胞增殖和诱导MFC细胞凋亡，可剂量和时间依赖性的提高细胞内钙浓度，降低细胞线粒体膜电位，增@caspase 3的表达，但这　　些作用均~ ~BAPTA(20~tmo1)抑制.

　　结论：G.Rh 可激活细胞内Ca 信号转导途径，从而最终通过线粒体凋亡途径诱导胃癌细胞凋亡.

　　关键词：人参皂苷单体R h2;凋亡;胃癌;流式细胞仪;免疫印迹

　　引言

　　人参皂苷单体Rh2(ginsenoside Rh2)是从人参中分离出的原人参二醇型低糖链皂苷单体，多项研究证实，G.Rh 可以通过诱导细胞调亡或分化有效地抑制多种肿瘤细胞D-7]的增殖活性，而目前尚无其对胃癌增殖抑制的研究报道.目前已揭示的参与G—Rh，诱导凋亡的信号分子包括JNK【8]、Cdk2 ，PKC8 m 等，然而G.Rh2上调这些蛋白酶活性的分子机制仍不明晰.2006年，Hamct af11]首次发现G—Rh，可使HeLa细胞线粒体的Ca外升高，随之产生大量ROS，进而激活JNK途径，并最终通过线粒体凋亡通路诱导MFC细胞凋亡.本研究以小鼠前胃癌MFC细胞为受试细胞，探讨G.Rh 在诱导胃癌细胞凋亡过程中Ca抖信号转导途径的激活及下游线粒体凋亡通路活化的分子机制.

　　1材料和方法

　　1.1材料G—Rh 由吉林大学分析化学教研室提供，IMDM培养基购自美国Gibco公司，新生小牛血清购自杭州四季清生物有限公司，Hoechst 33258购自凯基生物，Annexin V-FITC试剂盒购自晶美生物工程有限公司。动物细胞凋亡DNA Ladder提取试剂盒购自北京鼎国生物公司，Rhodamine123购[~Sigma公司，Fluo一3，AM购自Molecular Probes公司，caspase 3购白天津灏阳，BAPTA购自北京海德生物.

　　1.2方法MFC细胞由本室冻存，常复苏后，培养和维持在体积分数为100 mL/L新生小牛血清IMDM培养液里，置CO2培养箱(37"C，50 mL/LCO )培养，取对数生长期细胞经24 h无血清培养后。分组进行实验.

　　1.2.1分组及细胞处理对数生长期的MFC细胞经24 h无血清培养后，将密度为1.0X 10 /L的MFC细胞分为：空白对照组、G—Rh 各组(3、10、30 mg/L)。检测早期细胞凋亡率和晚期细胞凋亡率：将MFC细胞分为：空白组、G.Rh (10mg/L)组、G—Rh2(10 mg/L)+BAPTA(20 i.tmo1)组、BAPTA(20 I.tmo1)组，检测细胞核形态，线粒体膜电位，细胞内钙各项实验指标.

　　1.2.2流式细胞仪分析收获细胞，用4"C预冷的PBS洗两次，用250 uL结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度为1 x 10 /L，取100 L细胞悬液于5 mL流式管 ，加入5 L mexinV-FITC(150mg/L)和10 L碘化丙锭(120 mg/L)，混匀后室温避光孵育15 min，在反应管中加400 laL PBS，流式细胞仪(FACS)分析细胞凋亡率.

　　1.2.3琼脂糖凝胶电泳检测晚期细胞凋亡药物处理24 h后，收集细胞，按动物细胞凋亡DNALadder提取试剂盒要求提取DNA，每个泳道上样量为10 L，用20 g/L琼脂糖凝胶电泳，电压为4 V/cm，经EB染色后，凝胶成像系统下观察和照相.

　　1.2.4细胞形态学观察细胞经药物处理12 h后，在同一视觉域内用Hoechst 33258(10 mg/L)进行核染色，然后在荧光显微镜(Leica Microsystems Wetzlar GmbH，Germany)下观察细胞核形态并记录.

　　1.2.5共聚焦显微镜测定线粒体膜电位和细胞内钙线粒体膜电位[1 2-13]：收集细胞，加入0.026mmol/L的Rhodamine123染液200 laL，37℃避光孵育10 min，用PBS洗3次后，每孔选4个视野，每个视野观察50个细胞，以平均荧光强度变化反映细胞线粒体膜电位的相对水平，荧光探针Rhodamine123进入细胞。其激发的荧光强度与细胞内线粒体膜电位成正比，所得荧光强度以软件处理即得激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位.细胞内钙：收集细胞，加入10 lamol/L的Fluo一3，AM负载液200 laL，37"C避光孵育40 min，用Hepe液洗涤3次后，每孔选4个视野，每个视野观察50个细胞，以平均荧光强度变化反映细胞内游离钙浓度的相对水平.荧光探针Fluo一3/AM进入细胞，其激发的荧光强度与细胞内游离钙离子的浓度成正比，所得荧光强度以软件处理即得激光共聚焦显微镜检测细胞内钙浓度.

　　1.2.6 Western blotting分析caspase 3在细胞中的表达具体方法见分子克隆实验指南.统计学处理采用image-protein plus统计软件进行处理.组间比较采用实验，结果采用mean+SD表示.

　　2结果

　　2.1 G—Rh，对MFC细胞早期凋亡的影响流式细胞仪分析可见，与对照组相比G—Rh 各给药组，MFC细胞凋亡率分别为24%、29.7%和43%，与对照组凋亡率1.9%相比显著增加，且呈明显