人参皂甙Rh2对人乳腺癌MCF7_AdrR细胞增殖和凋亡的影响

　　近年研究发现,人参具有抗癌活性,其主要活性成分人参皂苷能诱导细胞分化和凋亡,从而发挥抗肿瘤作用。人参皂苷单体Rh2(G -Rh2)是从红参中分离得到的原人参二醇型单糖链皂苷单体化合, 是人参的主要抗癌成分。国内外报道[ 3- 9], Rh2对多种肿瘤细胞 (如小鼠黑色素瘤 B16细胞、C6胶质瘤细胞、人肝癌细胞 SK- HEP- 1等 )具有增殖抑制和诱导凋亡作用。为此本实验以人乳腺癌 MCF7/AdrR细胞株为受试细胞, 研究 GS- Rh2的诱导凋亡作用, 旨在进一步阐明人参抗肿瘤作用机制,为其应用于肿瘤的临床治疗提供实验依据。

　　材料与方法

　　1 材料

　　细胞培养 人耐药乳腺癌细胞 MCF7/AdrR, 购自中国科学院上海细胞研究所; 细胞贴壁生长, 用含10% 胎牛血清的 RPM I1640培养基, 加阿霉素维持其耐药性, 于 37 、5% CO2、95% 空气饱和湿度培养箱培养, 适时传代。药品与试剂 人参单体 Rh2, 纯度﹥ 98% , 上海融禾医药科技发展有限公司提供; 盐酸阿霉素 ( adriam yc in, ADM ), 浙江海正药业公司提供。四甲基偶氮唑盐, 购自上海实生生物有限公司; 兔抗 Fas( 1 500)多克隆抗体、鼠抗 Bax( 1 500)单克隆抗体、鼠抗 Bcl- 2( 1 500 ) 单克隆抗体和兔抗 B cl- xL ( 1 500) 多克隆抗体, 均购自美国 Santa Cruz公司; 鼠抗 - actin单克隆抗体, 购自美国 S igm a公司; 二抗 ( 羊抗兔及羊抗鼠 ), 购自美国 Rockland公司; TRITC标记的羊抗鼠 IgG, 购自上海鼎国生物技术有限公司; Hoechst 33258细胞凋亡检测试剂盒, 购自碧云天生物技术研究所。

　　仪器 培养箱和超净工作台, Thermo Forma公司产品; 垂直式电泳仪和湿转装置, 购自美国 Bio- Rad公司; 低温高速离心机, 美国 Beckman coulter公司产品;酶标仪, 美国 Moular Device公司产品; 倒置显微镜, 日本 N ikon公司产品。

　　2 方法

　　2 1 分组将对数生长的 MCF7/AdrR细胞, 按下述均分成 6组:①对照组: 细胞加入等量的溶剂; ②ADM 组: 细胞加阿霉素 ③Rh2组: 细胞加 ④ ADM + 3 个剂量 Rh2组: 细胞加阿霉素和分别加不同浓度。

　　2.2 M TT法检测 GS- Rh2对细胞生长的抑制作用取对数期细胞制成细胞悬液, MCF7/Adr以 4 &103个细胞 /孔接种于 96孔板, 每孔 100 L, 24 h后,药物组加入不同浓度的 GS- Rh2, 使终浓度分别为10, 20, 40, 80, 160 ; 对照组与空白对照组加培养液 100 L。

　　分别在加药后 24, 48, 72 h, 用MTT法检测各孔中细胞的抑制率。用酶标仪检测 490 nm 处吸光度值( A ) , 每组设 3个复孔, 实验至少重复 3 次。

　　2.3 H oechst 33258染色检测细胞凋亡

　　将细胞接种于置有盖玻片的六孔板中, 待细胞生长至 70% ~ 80% 融合时, 用含0.5% 新生牛血清的 1640培液同步化 20 h, 加入相应的药物继续培养 24 h, 结束培养, 弃培液; 按照 Hoechst 33258细胞凋亡检测试剂盒说明书进行: 室温固定 10m in, 用 PBS室温洗涤 5m in3次; 加入 H oechst33258染色液, 室温染色 5 m in后, 用抗荧光淬灭封片液封片; 荧光显微镜下观察并拍照, H oechst 33258激发波长 345 nm, 发射波长 487 nm, 阳性信号呈蓝色,凋亡细胞的细胞核呈致密浓染或呈碎块状致密浓染,

　　实验至少重复 3次。

　　2.4 流式细胞仪

　　将细胞接种于 6 cm培养皿中,待细胞生长至 70% ~ 80%融合时, 用含 0 5%新生牛血清的 1640培液同步化 20 h, 加入相应的药物继续培养48 h, 结束培养, 收集培液, 可细胞刮勺, 轻柔刮下贴壁细胞, 用预冷的 PBS吹打, 转移培液和细胞, 至预冷的15 mL 离心管中, 于 4 、2000 r#

　　m in- 1离心 5m in, 弃上清; 加入预冷的柠檬酸固定液 1 mL, 重悬细胞。送中国科学院上海细胞生物研究所, 作流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期, 实验至少重复 3次。2 5 W estern b lot检测当细胞生长融合至 30% ~ 40% 时, 将 MCF7/AdrR细胞的培养液, 加入相应的药物作用 48 h后, 细胞裂解液提取细胞总蛋白, 定量后取等量样本, 进行SDS- PAGE 电泳分离; 然后将蛋白转移至 PVDF 膜上。将膜在封闭液中封闭 2 h, 分别与 Fas、Bax、Bcl-2和 Bc l- x l以及 - actin 的一抗于 4 孵育过夜。洗膜后, 再与二抗室温孵育 1 h; TBST室温洗膜 5 m in&3次; 将膜转入新鲜配制的 ECL 化学发光孵育液中, 室温孵育 5m in; 转入 X光暗盒中, 曝光 3 m in, 显影, 定影, 实验均至少重复 3次。

　　3 统计学方法

　　用 SPSS10 0软件完成统计学处理, 实验数据以均数 ∋ 标准差表示, 组间分析比较采用 t 检验, P <0.05表示差异有统计学意义。

　　结 果

　　1 G S- Rh2对 MCF7/AdrR细胞增殖抑制作用用 MTT法检测 GS- Rh2对 MCF7/AdrR细胞增殖抑制作用, 结果发现 GS- Rh2能明显抑制 MCF7/AdrR细胞的增殖, 其抑制作用呈现出剂量 - 时间依赖性,与对照组比较有统计学差异 (P < 0 05),不同浓度人参皂甙 Rh2( GS - R h2) 在不同时间点对M CF7 /A drR 细胞的增殖抑制作用。

　　讨 论

　　肿瘤的发生发展是一种多基因、多步骤、多阶段的复杂过程, 许多抗肿瘤药物都可诱导或促进肿瘤细胞凋亡而发挥治疗作用。本研究证实, 人参中的活性成分人参皂苷 - ( GS- Rh2) 能抑制人乳腺癌 MCF7 /A drR细胞增殖并诱导其凋亡。细胞凋亡是受基因调控的、主动的细胞死亡过程, 有其特征性的形态和生化特征。凋亡细胞的主要特征是细胞增殖抑制, 流式细胞仪可检测到出现凋亡细胞特征峰 ( sub- G1峰 ), 细胞胞浆浓缩致密, 核染色质凝集, 核裂解形成凋亡小体。本实验从形态学、流式细胞仪检测, 来确认细胞凋亡的发生。增殖抑制实验结果表明, 3个浓度Rh2均能使 MCF7/AdrR细胞数量明显下降, 其抑制作用呈明显的剂量 - 时间依赖性。

　　Andrews等认为, 细胞凋亡是由正常的细胞周期改变引起的, 细胞凋亡与细胞周期阻滞有关, 细胞阻滞于哪一期, 凋亡就发生在哪一期。现代药理学研究证实, 人参中含有多种具有抗肿瘤作用的皂苷, 它们能诱导细胞凋亡及引起细胞周期阻滞, 从而抑制肿瘤生长。本实验用流式细胞仪检测也表明: 3个浓度 Rh2+ ADM 组, 均能使 M CF7 /AdrR 细胞发生明显的凋亡, 凋亡细胞 百分率分 别为 26 27%, 39 15%,47 08% 。

　　而且 Rh2+ ADM 组还能诱导 MCF 7 /AdrR细胞的 G0/G1期阻滞, 阻滞细胞由 G1期向 S期转化,Rh2+ ADM 组随 Rh2作用浓度的增加, 使 G0/G1期细胞含量上升及 S期细胞下降, 表明 GS- Rh2可通过抑制细胞 DNA的合成, 来诱导细胞发生凋亡, 推断这可能是 GS- Rh2完成其抗肿瘤作用的机制之一。

　　通过H oechst 33258染色观察了 Rh2对 MCF7/AdrR细胞凋亡的情况, 均发现有典型的凋亡细胞, 并可见到凋亡小体。Bc l- 2基因已证实为癌基因; Bax作用则相反。B cl- 2和 Bax形成了细胞凋亡的正负调控, 诱导细胞凋亡。本实验结果显示, 随 Rh2+ ADM 组的Rh2浓度增加, Bcl- 2 /Bax比例下调, 而 Bcl- x l蛋白的表达, 在药物作用前后无明显的变化, 说明 GS- Rh2诱导 MCF7 /AdrR细胞的凋亡过程, 可能下调 Bcl- 2蛋白和上调 Bax蛋白的表达, 通过凋亡通路中线粒体的途径实现的。 Fas是肿瘤坏死因子受体 ( TNFR) 和神经生长因子 ( NGF) 受体家族的细胞表面分子, Fas配体 ( FasL) 是 TNF 家族的细胞表面分子。 Fas/FasL 的主要作用是可以触发细胞凋亡。

　　本实验结果显示, Fas蛋白表达, 随药物浓度的 增 加 而明 显 增 强, 说明 GS - Rh2能上调MCF 7 /AdrR 细胞表面的 Fas蛋白表达, 通过凋亡通路中的死亡受体通路, 促进细胞亡。提示 GS- Rh2可以通过调节凋亡相关蛋白的表达, 参与调控人乳腺癌细胞的凋亡。肿瘤的发生、发展与细胞凋亡异常有密切的关系。许多抗肿瘤药物都可诱导或促进肿瘤细胞凋亡而发挥治疗作用。