人参皂苷Rh2对小鼠X射线辐射损伤的防护作用

　　作 者：王振华,赵卫平,刘箐,李宁,张红

　　摘 要：目的 旨在探讨人参皂苷Rh2对x射线辐射损伤所致遗传毒性和免疫损伤的保护作用。方法 小鼠接受4 Gy x射线令身照射后，灌胃给予5、lO和20 ms/kg剂量的人参皂苷Rh2，24 h后以碱性彗星电泳方法观察小鼠外周血淋巴细胞DNA损伤程度，以吖啶橙荧光染色法观察小鼠骨髓微核形成情况，以MTT法测定刀豆球蛋白和脂多糖诱导的脾淋巴细胞转化率。结果 人参皂苷Rh2剂量依赖性地抑制了X射线所致小鼠外周血DNA损伤和骨髓微核形成，对辐射所致脾淋巴细胞转化能力下降也有明显的防护作用。结论人参皂苷Rh2对x射线所致遗传损伤和辐射防护均有明显保护作用，有望成为辐射防护药物。

　　关键词：人参皂苷Rh2;x射线;辐射防护

　　疾病的放射性诊疗措施正被日益广泛应用，其危险性应受到重视。研究表明，肿瘤的放射治疗可引起继发性肿瘤H引，x射线和计算机断层扫描等I临床常规诊断手段也有诱发肿瘤的可能p o，胎儿或儿童更易受到伤害H剖。对处于辐射危险的人群采取一定的防护措施很有必要。传统中药人参对紫外线、Y射线和x射线所致辐射损伤均具有防护作用∽1，但其活性物质基础仍不明确。人参皂苷Rh2是人参有效成分之一，本研究观察其对x射线辐射损伤的影响，旨在为人参及其活性成分用于辐射防护提供依据。

　　1.材料与方法

　　1.1 实验动物：健康SPF级BALB/C小鼠，雌雄各半，5—6周龄，体重18—22 g，由兰州大学实验中心提供。

　　1.2 主要试剂：人参皂苷20(S)一Rh2由烟台大学海洋学院马成俊教授提供，纯度为99.1%。RPMI1640培养基为美国Gibco公司产品;胎牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品;胰蛋白酶、噻唑兰(M1vr)、二甲基亚砜(DMSO)、吖啶橙为美国Sigma公司产品。其余试剂采用国产分析纯产品。

　　1.3 分组照射及给药：BALB/C小鼠50只，适应性饲养1周后，按体重随机分为5组，每组10只，分别为健康对照组、辐照对照组、辐照后高(20 mS/kg)、中(10 ms/kg)、低(5 mg/kg)剂量人参皂苷Rh2干预组。各辐照组小鼠采用PRIMUS型医用电子直线加速器(德国西门子)，能量为6 MeV的电子束产生的x射线治疗机对小鼠进行全身照射，照射源皮距为100 cm，吸收剂量率为0.5 Gy/min，照射剂量为4.0 Gy。照射后人参皂苷Rh2干预各组小鼠灌胃给予相应剂量人参皂苷Rh2(0.5%羧甲基纤维素钠混悬)，正常对照组和辐照对照组灌胃给予等体积0.5%羧甲基纤维素钠。辐照后24 h，各组小鼠眼眶采血，肝素抗凝，测定外周血淋巴细胞DNA损伤程度。无菌取脾，分离脾淋巴细胞测定脾淋巴细胞转化率。分离双侧股骨，收集骨髓细胞观察骨髓细胞微核情况。

　　1.4 彗星电泳测定小鼠外周血淋巴细胞(PBLs)DNA损伤程度：DNA损伤分析采用碱性单细胞电泳分析法(或称彗星电泳)，实验方法如文献[10]所述。未损伤细胞的DNA为圆形，而受到损伤的细胞DNA带有彗星样尾巴。每只小鼠照片中随机选用100个PBLs，利用CASP软件对DNA损伤情况进行分析，以尾矩(Tail moment，TM)作为DNA损伤指标。公式为：TM=彗尾长度×彗尾DNA占细胞总DNA的百分率。

　　1.5 骨髓微核率测定：按胡永宁等¨副方法，采用吖啶橙荧光显色进行观察。分离小鼠股骨后以1%柠檬酸钠冲洗出骨髓细胞，吹打均匀后离心，1500 r/min离。05 min，弃去上清，细胞团以剩余液体混匀后涂片，甲醇固定。100“s/ml吖啶橙(pH6.8)染色3 rain，置于pH 6.8磷酸缓冲液漂洗3 rain，加盖玻片，于40倍物镜下计数1000个嗜多染红细胞(PCEs)中有微核细胞数目。计算微核率，以千分率表示。

　　1.6 小鼠脾淋巴细胞转化能力测定：按文献[14]方法进行。小鼠脾脏于100目不锈钢网上用注射器芯研碎，冰Hanks冲洗，收集滤过的脾细胞悬液，1500 r/rain离一L,IO rain，弃上清。细胞团中迅速加入0.83%氯化铵1 ml后迅速吹打混匀，裂解红细胞，余下细胞以含1%胎牛血清的冰Hanks液洗涤3次。用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100斗g/ml链霉素的RPMI 1640完全培养液调整脾细胞浓度为1×106/ml。于96孔板中每孔加入100¨l脾细胞悬液，每只小鼠脾细胞悬液加9个平行孔，其中3孔细胞加入含lO恤g/ml刀豆蛋白A(ConA)的完全培养液100 wl作为T淋巴细胞增殖试验孔，另有3孔加入含20斗g/ml脂多糖(LPS)的完全培养液100“l作为B淋巴细胞增殖试验孔，余下3孔加入100肛I完全培养液作对照孔。加好后培养权于微量振荡器振荡混匀。将培养板置37℃、5%CO：恒温培养箱中培养68 h。于每孔加入10斗lMrrr(10 ms/m1)溶液，继续培养4 h。3000 g离心10 rain，轻轻吸去上清，每孔加入150斗l DMSO溶解溶解甲_|};l结晶，酶标仪(Thermo Vario Scan)测定570 nm光吸收，630 nm作参考波长。根据各孔吸光度计算每只小鼠对应的脾淋巴细胞的刺激指数(SI)，作为脾淋巴细胞转化能力指标：刺激指数(SI)=试验孑L与对照孔的吸光度(A)平均值之比。

　　1.7 统计学处理：实验数据以菇±s表示，采用SPSS 10.0软件，采用单因素方差分析(ANOVA)，组间资料采用t检验(LSD.t)。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2.结 果

　　2.1 人参皂苷Rh2对X射线辐射所致外周血DNA损伤的影响：结果见表l。4 Gy X射线全身照射可致小鼠外周血淋巴细胞DNA严重损伤，与正常组比较差异有统计学意义(t=14.053，P<0.01)。小鼠灌胃给予5、10和20 ms/kg人参皂苷Rh2，各剂量组对辐照所致DNA损伤有明显防护作用，且其作用呈剂量依赖性。

　　注：与健康对照组比较，t=14.053、15.703，P<0.01;与辐照对照组比较，6t=2.299，P<0.05;。t=3.528、4.465、5.448、6.569、6.444。P<0.Ol

　　2.2 人参皂苷Rh2对X射线辐射所致骨髓细胞微核的影响：经吖啶橙染色后，细胞形态完好，有核细胞呈黄绿色，PCE显桔红色荧光，所含微核为圆形，发出黄绿色荧光，易于分辨;成熟红细胞无荧光，显示为暗影。结果见表1。4.0 Gy X射线全身照射可致小鼠骨髓细胞微核率明显升高，与正常组比较，差异有统计学意义(t=15.703，P<0.01)。小鼠灌胃给予5、lO和20 mg/kg人参皂苷Rh2，对辐照所致骨髓细胞微核率升高均有明显抑制作用，且其作用呈剂量依赖性。

　　2.3 人参皂苷Rh2对x射线辐射后小鼠脾淋巴细胞转化能力的影响：结果见表2。4 Gy x射线全身照射可致ConA和LPS刺激的小鼠脾淋巴细胞转化能力明显降低，与正常组比较，差异有统计学意义(t=7.301、4.393，P<0.01)。小鼠灌胃给予5、10和20 mg/kg人参皂苷Rh2，可剂量依赖性地增强ConA和LPS刺激的小鼠脾淋巴细胞转化能力，10和20 mg/kg人参皂苷Rh2作用，差异有统计学意义(t=2.151～4.659，P<0.05)。

　　3.讨 论

　　辐射所造成的机体损伤可分为两类，一类是辐射剂量超过机体可承受的阈剂量而造成的皮肤灼伤、毛发脱落等现象，为确定性效应;另一类是远低于阈剂量下辐射造成的不可预知的远期效应，如致癌和遗传损伤，为非确定性效应，后者是目前正大规模推广使用的放射性诊断技术有可能给人体带来损伤的主要原因。另外，大剂量辐射还可导致免疫功能细胞周期阻滞，甚至发生凋亡，从而造成免疫功能低下。人参皂苷Rh2作为口服人参后能吸收入血的主要成分之一，其药理活性受到广泛关注，尤其在肿瘤治疗方面，已发现其对多种化疗药物具有增效作用。以其为主要活性成分研发的人参次皂苷Rh2作为肿瘤辅助治疗用药开展临床研究。本研究采用DNA损伤、骨髓细胞微核和脾淋巴细胞转化实验，发现人参皂苷Rh2对大剂量x射线辐射所致DNA损伤，骨髓微核细胞形成和免疫抑制均有明显防护作用，表明人参皂苷Rh2有望成为辐射防护药物。

　　人参皂苷Rh2为人参二醇组皂苷体内代谢产物，其活性可能反映了人参的部分药理活性【19】。刘冰等、采用小鼠骨髓微核细胞和精子畸形作为检测指标，对二醇组人参皂苷诱变作用进行研究，未发现其有诱变作用。本实验也未观察到人参皂苷Rh2对正常小鼠外周血DNA损伤和骨髓微核形成有明显影响等旧¨以人参皂取物、总皂苷和二醇组皂苷为研究对象，研究其对1射线照射小鼠免疫功能和机体损伤的影响，发现二醇组皂苷对辐射损伤具有明显保护作用。结合本研究结果，推测人参皂苷Rh2可能是人参对辐射防护的主要有效成分。

　　已有研究表明DNA损伤后机体修复系统的启动是辐射防护的重要机制之一。研究发现，与人参皂苷Rh2具有相同母核结构的人参皂苷CK(compound K)对紫外线造成的角质形成细胞DNA损伤和凋亡具有明显抑制作用，其机制是激活参与DNA损伤后碱基切除修复系统的两个关键分子——XPC和ERCCl的表达，从而促进了损伤DNA的修复。本研究尚未揭示人参皂苷Rh2对辐射损伤防护的分子机制，人参皂苷Rh2辐射防护作用可能亦与促进受损伤DNA修复有关，仍需深入研究来阐明。

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