人参皂苷Rh2硫酸化衍生物抗炎作用的分子机制

　　摘要：通过构建的细菌脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞(RAW264.7)的体外炎症模型，研究了不同质量浓度人参皂苷Rh2硫酸化衍生物B2(Rh2-B2)对TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10合成的影响，以及对NF-κB信号通路的影响。结果显示，1mg/L和5mg/L的人参皂苷Rh2-B2能显著抑制RAW264.7合成TNF-α、IL-6和IL-1β(P<0.01)，同时显著促进IL-10的合成(P<0.01)，并且通过显著抑制IκBα的降解而阻止NF-κB/p65易位入核(P<0.01)。结果表明，人参皂苷Rh2-B2可能通过阻断NF-κB信号通路，抑制LPS诱导的炎性细胞因子的产生，进而发挥其抗炎作用。

　　人参皂苷是人参的主要有效成分之一，其结构由苷元和糖或糖链组成，为达玛烷型四环三萜类化合物。人参皂苷Rh2是由人参中提取的天然活性成分，属于二醇组皂苷，其具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等多种药理活性。但由于该皂苷水溶性较差，毒性较大，限制了其在临床上的开发应用。为了获得生物活性强、毒性较小、水溶性较好的药物，本试验通过 Wolfrom法对人参皂苷Rh2的结构进行了硫酸化的修饰，得到一种新的衍生物，将其命名为人参皂苷Rh2衍生物B2(简称人参皂苷Rh2-B2)。

　　在炎症过程中，巨噬细胞在特异性和非特异性免疫反应中发挥着关键的作用。LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的组成成分，也即内毒素。资料表明，LPS通过细胞的表面受体激活巨噬细胞，然后引起巨噬细胞分泌大量促炎性细胞因子，例如 TNF-α、IL-6、IL-1β和NO等，这些因子的过度产生将会导致机体组织损伤和多器官功能衰竭。而细胞因子IL-10的上调能够抑制炎性细胞因子的产生，降低内毒素造成的炎症反应和组织损伤。TNF-α为内毒素发病早期的重要介质，内毒素可以通过不同的信号转导，激活NF-κB等信号通路，促进TNF-α、IL-6、IL-1β、NO等细胞因子的释放，因此可以通过降低炎性细胞因子水平并阻断其信号通路的方式来控制一些炎症反应。已有研究表明，人参皂苷Rh2具有一定的抗炎作用。但其衍生物是否具有抗炎作用仍不清楚，故本试验对人参皂苷Rh2-B2的体外抗炎作用进行了研究。

　　1 材料与方法

　　1.1　细胞　小鼠RAW264.7单核-巨噬细胞系购自北京细胞中心。

　　1.2　药品和试剂　人参皂苷Rh2，购自吉林大学白求恩医学部，含量>95%;人参皂苷Rh2-B2由本室制备，红外光谱及质谱鉴定，相对分子质量为724，是Rh2分子上增加了1个-SO3Na基团，纯度>90%;细菌脂多糖(LPS)、二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT)均购自Sigma公司;DMEM 高糖培养基购自美国Invitrogen-Gibco公司;胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司;相关细胞因子Elisa试剂盒均购自 R&D公司;兔 NF-κB/p65和IκBα多克隆抗体，小鼠 NF-κB/p-p65和p-IκBα单克隆抗体均购自Cell　Signaling　Technology公司;辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG购自美国PTG公司。

　　1.3　主要试验仪器　德国 Heraeus　CO2培养箱;ELx酶标仪，美国Bio-Tek　Instruments　Inc公司生产;电泳仪和转膜仪均购自北京六一仪器厂。

　　1.4　细胞培养　细胞培养于10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，传代后接种于24孔培养板中。共分为3组，分别为空白组(无药物和LPS处理)、LPS(1mg/L)处理的阳性对照组、人参皂苷Rh2-B2(分别是0.2、1、5mg/L)+LPS处理组，先加不同质量浓度的人参皂苷Rh2-B2预处理细胞1h，而后加LPS处理12h，每组各为3个平行。

　　1.5　人参皂苷Rh2-B2的毒理学评价　应用 MTT检测方法进行评价。取对数期生长RAW264.7细胞接种于96孔培养板中，细胞密度为每孔4×105个，37℃5%CO2条件下培养24h后，每孔加入不同质量浓度的人参皂苷Rh2-B2预处理1h，加LPS刺激细胞18h，而后每孔加入 MTT溶液(5g/L)20μL，37℃继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，而后加入150μL　DMSO，振荡10min，选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值(D值)。

　　1.6　细胞因子的测定　不同质量浓度的人参皂苷Rh2-B2预处理细胞1h，而后加LPS处理12h，取培养的细胞上清液100μL，按照细胞因子ELISA检测试剂盒的程序操作。

　　1.7　Western-blot法检测NF-κB/p65和IκBα的表达　不同质量浓度的人参皂苷Rh2-B2预处理细胞1h，加LPS处理12h，然后将各组细胞提取蛋白质并进行定量后，电印迹转移法将凝胶内的蛋白转至硝酸纤维素膜。5%脱脂乳室温封闭1h，而后分别加入相应的一抗(稀释度1∶1　000)，4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入 HRP标记的二抗(稀释度1∶5　000)，室温孵育1h，TBST洗膜3次后，化学发光法显色。使用成像分析系统对显色条带进行光密度分析。

　　1.8　数据统计　数据以x±s表示，数据间差异的显著性采用SPSS13.0软件，应用 ONEWAY-AN-VONA方法进行分析。

　　2 结果

　　2.1　人参皂苷Rh2-B2的毒理学评价　由图1可知，0.2、1、5mg/L人参皂苷Rh2-B2预处理RAW264.7巨噬细胞1h，LPS处理12h后，与空白对照组和LPS(1mg/L)处理阳性对照组相比，细胞存活率没有显著差异，说明人参皂苷Rh2-B2在试验质量浓度范围内对RAW264.7细胞不具有细胞毒性作用。

　　2.2　人 参 皂 苷 Rh2-B2 对 体 外 LPS 诱 导 的RAW264.7巨噬细胞TNF-α、IL-6和IL-1β分泌的影响　由图2可见，空白组 RAW264.7细胞培养12h后，分泌的TNF-α水平为(75.12±12.05)ng/L。LPS(1mg/L)处理12h后TNF-α的分泌显著增加，达到(351.74±38.95)ng/L。当加入人参皂苷Rh2-B2(0.2、1、5mg/L)预处理RAW264.7巨噬细胞1h，LPS处理12h后，1mg/L和5mg/L质量浓度的人参皂苷Rh2-B2能极显著抑制TNF-α的分泌，抑制率分别为(25.5±3.7)%(P<0.01)和(40.0±4.4)%(P<0.01)。

　　由图3可知，LPS(1mg/L)处理RAW264.7细胞12h后，IL-6的质量浓度为(90.8±3.46)ng/L，而空白对照组为(12.43±1.39)ng/L。当0.2、1、5mg/L的人参皂苷Rh2-B2预处理RAW264.7巨噬细胞1h，LPS处理12h后，可以观察到1mg/L和5mg/L质量浓度的人参皂苷Rh2-B2对IL-6抑制率分别为 (30.0±2.3)%(P<0.01)和 (41.5±5.4)%(P<0.01)。

　　由图4可见，LPS(1mg/L)处理细胞12h后，分泌的IL-1β为(46.65±7.72)ng/L，显著高于空白对照组(10.09±1.45)ng/L。同样，当加入人参皂苷Rh2-B2(0.2、1、5mg/L)预处理RAW264.7巨噬细胞1h，LPS处理12h后，1mg/L和5mg/L质量浓度的人参皂苷Rh2-B2对IL-1β抑制率分别为(22.1±5.6)%(P<0.01)和(29.6±4.3)%(P<0.01)。

　　2.3　人 参 皂 苷 Rh2-B2 对 体 外 LPS 诱 导 的RAW264.7巨噬细胞IL-10分泌的影响　由图5可知，空白对照组细胞分泌的IL-10为(24.31±7.89)ng/L，显著低于LPS(1mg/L)处理的阳性对照组(57.17±19.08)ng/L。当加入人参皂苷 Rh2-B2(0.2、1、5mg/L)预处理RAW264.7巨噬细胞1h，LPS处理12h后，1mg/L和5mg/L质量浓度的人参皂苷Rh2-B2可以显著促进IL-10的分泌，促进率分别为(40.6%±18.8)%(P<0.01)和(86.0±55.1)%(P<0.01)。

　　2.4　人参皂苷Rh2-B2对LPS诱导RAW264.7细胞NF-κB/p65和IκBα活性的影响　从图6、7可看出，用LPS(1mg/L)刺激RAW264.7巨噬细胞12h后，与空白对照组相比，NF-κB/p65和IκBα的磷酸化水平显著升高，而两者的非磷酸化水平显著降低。当加入人参皂苷Rh2-B2(0.2、1、5mg/L)预处理RAW264.7巨噬细胞1h，LPS处理12h后，1mg/L和5mg/L质量浓度的人参皂苷Rh2-B2不仅可以显著抑制 NF-κB/p65和IκBα的磷酸化水平，而且可以显著提高两者的非磷酸化水平。

　　3 讨论

　　前期研究表明，人参皂苷Rh2-B2能显著促进小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活性，故推测该衍生物可能通过影响细胞因子的产生，进而影响机体的免疫功能和炎症反应。本试验首先观察了与炎症密切相关的细胞因子变化情况。由于 TNF-α、IL-6和IL-1β水平的升高常被作为炎症发生中细胞因子级联反应的启动及其严重程度的标志，为此选择TNF-α、IL-6和IL-1β作为细胞因子的代表，观察给予不同质 量 浓 度 的 人 参 皂 苷 Rh2-B2 后，LPS 刺激RAW264.7巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6和IL-1β水平的变化。本试验结果表明，LPS刺激细胞12h后，与空白对照组相比，细胞因子 TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌水平显著增加，说明成功构建了体外炎症模型。给予不同质量浓度的人参皂苷Rh2-B2(1、5mg/L)后，其能显著降低LS引起的TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌，从而起到抗炎的作用。此外，IL-10是体内最重要的抗炎因子之一，它能够抑制TNF-α、IL-6和IL-1β等细胞因子的产生，本试验结果显示，与LPS组的IL-10分泌水平相比较，人参皂苷Rh2-B2(1、5mg/L)+LPS处理组的IL-10分泌水平显著升高，表明人参皂苷Rh2-B2也可以通过提高抗炎因子水平来发挥抗炎作用。在此基础上进一步观察与促炎细胞因子密切相关的信号通路的变化情况。核转录因子κB(NF-κB)信号通路参与众多促炎细胞因子如 TNF-α、IL-6、IL-1β和iNOS等的基因转录调节。细胞在静息状态下，N-κB核转录因子以非磷酸化无活性的潜在状态存在于细胞浆中，与κB抑制蛋白(IκB)组成

　　异源多聚体(p50-p65-IκBα或p50-p65-IκBβ)，阻止其易位入核。因此，本试中空白对照组观察不到以磷酸化状态存在的 NF-κB/p65和IκBα。而当细胞受到LPS或促炎因子刺激时，胞浆中NF-κB三聚体复合体中的IκB发生磷酸化，从三聚体中解离出来，从而使p50-p65异二聚体表现出NFκB活性，活化的NF-κB核转录因子从细胞浆易位至细胞核内，并以磷酸化的形式存在，以上结论与本试验的结果相符。在细胞核中，NF-κB核转录因子可诱导众多炎症相关的特异基因的表达。研究结果表明，不同质量浓度的人参皂苷Rh2-B2(1、5mg/L)可以抑制IκBα的磷酸化和 NF-κB的活化。因此，人参皂苷Rh2-B2可能通过阻断NF-κB通路而发挥其抗炎作用。

　　综上所述，人参皂苷 Rh2-B2通过抑制 NF-αB的活化进而调节 TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10的分泌的方式发挥其抗炎作用。人参皂苷Rh2-B2对细胞因子的分泌和NF-κB通路都有影响，但其是否对细胞因子的mRNA水平和 MAPK通路有影响还需要进一步的研究，进而从分子和蛋白水平上更深入地揭示人参皂苷Rh2-B2抗炎作用的机制，为研制开发新型的抗炎药物奠定基础。