人参皂苷-Rh2的研究进展

　　作 者：徐景达

　　摘 要：本文报道有关人参苷-Rh2研究的新进展，其中包括提取、分离;化学修饰;半合成的制备方法，以及生理活性与构效关系等方面内容。以期达到更加深入研究，创新低毒高效天然化合物抗癌新药为目的。

　　关键词：人参皂苷;人参二醇;人参三醇;原人参二醇;原人参三醇;20(s)-人参苷-Rh2

　　1. 前言

　　1.1日本学者的发现

　　1983年北川勋等从红参中发现20(s)-人参苷-Rh2(ginsenoside-Rh2)，其化学名为20(s)-原人参二醇-3-氧-β-D-吡喃葡萄糖苷[20(s)-proto-panaxadiol-3-0-β-D-glucopyranoside](以下简称-Rh2)。此人参皂苷是在生晒参加工红参时，由于某些原人参二醇组人参苷受热分解，配基上的糖链经断链、降解而产生的次皂苷。北川勋等从日本长野县的红参中分得Rh2单体皂苷，其收率仅0.001%，为红参中含有的微量成分。

　　此后，小田岛肃等由北川勋提供的Rh2进行一系列体外细胞培养的抑瘤试验，发现Rh2对小鼠的肺癌细胞、大鼠的Morris肝癌细胞、小鼠的B16黑色素瘤细胞的增殖具有较明显的特异性抑瘤作用。且探讨Rh2并非直接杀伤癌细胞，也非提高宿主的免疫力，而是使癌细胞在其增殖过程中产生一种所谓的再分化的诱导作用，从而使癌细胞不能再增殖而停止一定的繁殖期中，诱导其逆转为正常细胞。但是，与Rh2分子结构相似的20(s)-人参苷Rh1则无此作用。Rh1属原人参三醇配基的皂苷，β-D-葡萄糖基结合在原人参三醇的C6位上，仅糖基结合位置之差异，其抑瘤作用大为不同，这说明了分子构效关系的重要意义。小田岛肃夫这一发现，引起世界学者的高度注视，企图寻求大量产生-Rh2的制备方法，研制一种高效低毒的抗癌天然药物，以克服化学合成抗癌药物的毒性，为癌症病人解除痛苦。

　　如上所述，北川勋从红参中分得的Rh2仅十万分之一的收率，只能用于细胞培养，不可能深入研究其药效学，毒理学。以及临床疗效，成为一种抗癌药物。为了达成此目的，其一，从人参或西洋参某药用部位中原人参二醇组配基含量较高的人参皂苷进行糖链的化学修饰，转化成为Rh2;其二，从天然产物中提到、分离获得原人参二醇配基，再与β-D-葡萄糖衍生物进行立体选择性的定向缩合，以半合成方法制取Rh2。

　　1.2我国环境对研究Rh2新药的优势

　　我国是人参的原产地，尤为吉林省抚松县被国家命为“人参之乡”，吉林省的人参资源吩咐。且于本世纪70年代以来国产西洋参栽培获得成功，吉林省的栽培面积占全国的58%，居全国栽培面积二分之一以上。因此，可利用脸颊的人参或西洋参的地上部位作为分取总皂苷的原料，再优选其化学修饰条件，使原人参二醇组配基的原始皂苷变为次皂苷，即可获得较大的Rh2。此法简便易行，且能发挥我国资源优势，切合实际，创制抗癌新药Rh2是具有前途的。另外，半合成Rh2方法虽有报道(后述)，但先导化合物的获取值得考虑，且合成过程中所需试剂较为困难，要求条件也较为严格，分离、纯化也较复杂，收率也较低等等。从我国厂家的生产条件看来，工业化制取Rh2尚需尽最大努力，可能实现。

　　1.3我国学者对Rh1、Rh2与肿瘤细胞增殖关系的研究

　　我国学者陈英杰等相继于1983、1988年从100kg鲜人参叶中分得60mg的Rh2;以金属钠法和氢氧化钠法水解人参皂苷Rh2得到Rh1。

　　宋长春等于1992年用西洋参茎叶总皂苷10g，溶于20%氢氧化钠溶液中，经乙酸乙酯萃取，得粗品3.2g。再经低压硅胶色谱法，以MeOH-H2O重结晶，的-Rh2142mg(收率1.86%)，马文彬等于1993年首次用Rh1及Rh2进行动物的体内试验。用宋长春等提供的-Rh1和-Rh2人参皂苷单体，应用小白鼠作为S18肉瘤细胞的载体，对载瘤细胞3天后的小白鼠分别进行腹腔注射Rh1与Rh2 50mg/kg.d，连续7天。应用FACSA420荧光细胞激活器对肿瘤细胞进行周期分析。结果表明-Rh2具有较强的抗癌活性，短期给药即可阻断S期细胞向G2期移行，造成S期肿瘤细胞堆积(P<0.05)，从而抑制S180肉瘤细胞的增殖;而-Rh1在本实验条件下，对肿瘤细胞周期影响不大。二者对抑瘤细胞的差异与以往一些体外实验结果一致，说明此差异与体内或体外实验无关，但与Rh1和Rh2的分子结构相关。以原人参二醇为配基的-Rh2的更有利于抑制肿瘤细胞生长。Rh1和Rh2的分子内均存在相同的疏水基和亲水基，但前者的葡萄糖基(亲水基)与原人参三C醇C6位上羟基成苷;而后者的葡萄糖基则与原人参二醇C3位的羟基成苷，二者分子结构的微笑差异，而使其抑瘤作用大不相同。大量实验表明，人参皂苷具有抑瘤作用，但却无直接杀伤肿瘤细胞的作用。它可通过增强机体免疫力，提高免疫细胞活性，简介抑制肿瘤细胞的生长。这说明-Rh2与人参皂苷对肿瘤抑制作用的机理是不同的。

　　陶丽华等对20(R)-人参苷-Rh2研究，也具有抑瘤作用。利用人参叶中含有的原人参二醇的Rh2和富含-Rg组的人参皂苷，称为20(R)-Rh2制剂，进行药效学研究。并报道对小鼠黑色素瘤B16细胞的分化诱导作用;对小鼠S-180A和小鼠EAC的诱导再分化作用;20(R)- Rh2的一半药理学;以及20(R)-Rh2制剂的毒理学研究等。还报道此抗癌新制剂的毒理学研究等。还报道此抗癌新制剂，作为商品即将问世。太田隆英等研究Rh2与其配基原人参二醇对B16黑色素瘤的吸收及代谢机理。其结果表明，原人参二醇的作用由于-Rh2，这说明了不仅Rh2对B16黑色素瘤具有抑制作用，而且其配基原人参二醇也具有抑瘤活性;而且更强。原人参二醇具有抑制B16黑色素瘤生长的活性，这是新的发现，且提示分子结构中3β-OH比其余D-葡萄糖基呈苷者作用更强，违反了以往对配基比其苷无作用或作用甚弱的提法。

　　1993年G.B.Elyakov等从西伯利亚远东地区的白桦鲜叶中分离出白桦烯三醇，其化学名为达玛-24-烯-3α12β，20(S)-三醇。分子结构与原人参二醇比较较3α与3β之差。以此为先导化合物，通过氧化、还原反应生成20(S)-原人参二醇，再与葡萄糖衍生物缩合，即生成Rh2.此文报道其乙酰化物的收率为50%，最终产物的收率未见报道。

　　2. 原人参二醇与原人参三醇的分子结构　

　　Rh2属四环三萜达玛烯原人参二醇的具单糖链结构的配糖体;Rh1属原人参三醇的配糖体。长期以来，人们对人参皂苷的分子结构进行过争议。与1960年后由于色谱、光谱技术的发展，由柴田承二研究组修正了以往的不正确结构，发现人参皂苷的分子结构除了个别的具有五环三萜齐墩果烷型配糖体外，均为四环三萜化合物。关于其配基的分子结构也是经长期争论而解决的。人参皂苷经酸完全水解，生成具有三甲基吡喃环结构的五环三帖醇的配基，由于当时误认为原始存在的配基，故命名为人参二醇和人参三醇。当人参皂苷经酸水解时，使△24 的侧锁环合;C20上-OH鱼C24的双键环合而发生构型的转变，由原来的S型便问R型。后来，经碱或酶分解证实人参二醇和人参三醇是人参皂苷的原始配基是错误的。而不环合的结构则是人参皂苷的真正配基。实际上，不环合的分子结构的人参皂苷配基，一个具有三个游离羟基即3β、12β、20β三个羟基;另一个具有四个游离羟基即3β、6α、12β、20β四个羟基。本应命名为人参三醇和人参四醇，为了保留原人参二醇与人参三醇的名称，且与之区别，特分别加上“原”字，即原人参二醇和原人参三醇。

　　Rh2即20(s)-原人参二醇-3β-D-吡喃葡萄糖苷;-Rh1即20(s)-原人参三醇-6α-D-吡喃葡萄糖苷。

　　当以化学修饰(降解)方法预制取较大量的-Rh2，以人参总皂苷或人参二醇组皂苷为原料时，并经酸水解时，分子中侧键的双键与C20位的-OH环合，则得不到20(S)构型的-Rh2;若以碱在缓和条件下水解时，则可获得具有侧链结构的20(S)-构型的--Rh2。从人参各部位分得的单体皂苷绝大多数是20(S)-构型的，但将其降解是糖链断开，只保留3β-位上的葡萄糖基，且C20位上价键构型不变，仍为20(S)构型，其降解条件、傍生物的分离等，是相当困难而复杂的问题。

　　从上述细胞培养或动物的抑瘤活性看来，小田岛肃夫等及马文彬等证明20(S)-构型的Rh2具有抑瘤作用。而陶丽华等使用20(R)-构型的--Rh2也显示出抑瘤作用。提示人参苷-Rh2的抑瘤作用与其分子结构C20位构型(S或R)不存在相关。说明-Rh2分子与癌细胞的作用中心不在C17位上的侧链或吡喃环上，而在-Rh2的分子其它部位。又据太田隆英等的报道，原人参二醇配基本身对B16黑色素瘤比-Rh2具有较强的抑瘤活性，这也提示-Rh2抑瘤作用与葡萄糖基的存在与否无关。从-Rh2抑瘤活性的构效关系上，这是很有意义的。值得今后深入探讨其抑瘤作用的机理，以分子水平的研究来回答这些问题。

　　3. 3-氧-β-D-吡喃葡萄糖基-达玛-24-烯-12β，20(S)-二醇(人参苷-Rh2)的半合成

　　原苏联远东科学院太平洋生物有机化学研究所的G·B·Elyakov 等从白桦树叶中提取、分离的桦木烯三醇(1)，即达玛-24烯-3α，12β，20(S)三醇，与20(S)-原人参二醇的分子结构相似，仅C3位上羟基的构型不同。

　　桦木烯三醇(1)在吡啶介质中鱼氧化剂反映进行氧化，3α位的仲醇基被氧化成酮基(2)，生成达玛-24-烯-3-酮-12β，20(S)-二醇(收率60-70%)。然后乙酰化，C12位上的-OH被乙酰化，即生成达玛-24-烯-3-酮-12β-乙酰氧-20(S)一醇(3)(收率100%)。继而，(3)再还原，3-酮基变为3β-羟基，即达玛-24-烯-12β-乙酰氧-3β，20(S)-二醇(4)(收率85-87%)。(4)与溴四乙酰葡萄糖缩合生成达玛24-烯-3β-四乙酰葡萄糖基-12β-乙酰氧-20(S)-醇(5)(收率50%)。(5)在甲醇中鱼甲醇钠进行醇解，被分解变为12β-羟基，即生成3-氧-β-D-吡喃葡萄糖基-达玛-24-烯-12β，20(S)-二醇((s)-人参苷-Rh2)(6)。反应过程如图2.

　　反应历程：为了使先导化合物桦木烯三醇的3α-OH变为3β-OH，故氧化C3位上的仲醇基为酮基，而12β-OH由于空间效应和20(S)-OH为叔醇基难被氧化，故C12及C20仍保留-OH。继之，乙酰化使12β-OH变为CH3CO-O-;而C20为-OH难以反应，从而不被乙酰化，如此有利于次步的苷化反应。使C3上的酮基再还原既生成β-OH，由于C12位上的-OH乙酰化变成CH3CO-O-基产生巨大空间效应是C20上的-OH又难以反应，故与葡萄糖衍生物苷化时，能立体选择性地定向与C3位-OH缩合进行苷化反应。我国学者刘惟(王差)等用人参二醇与溴四乙酰葡萄糖也合成了与-Rh2结构近似的化合物。

　　4. 达玛烷型三萜皂苷的构效关系

　　达玛烷型四环三萜化合物分子的碳架与甾体化合物的分子结构相似，具有亲脂性的环烷烃与亲水性的极性基如羟基等。因此与生物膜具有较强的亲和力。已有报道达玛烷型三萜皂苷对细菌具有抑制作用，如体外实验表明，能抑制革兰氏阳性菌(如金黄色葡萄状球菌);欧利希氏癌细胞的生长。对脂质生物膜具有稳定性作用。他们的生物活性依赖于配基上的侧链结构，糖链的数目及其与配基结合的位置。如具有侧链(20-羟基-24-希型)比其侧链环合(20,24-环氧型)的活性强。至于C3位上羟基的构型(α-或β-)是否与活性相关，有待研究。

　　具有一个葡萄糖基的葡萄糖苷的活性通常比连有两个葡萄糖基的更强;具有单糖链的比双糖链的人参苷有较强的抗肝细胞毒和抗肿瘤活性，如-Rh2。如上所述至于20(S)-或20(R)型的-Rh2均对癌细胞具有抑制作用，以及原人参二醇(配基)无糖链结合的对癌细胞也有抑制作用，这是首次报道。达玛烷型四环三萜化合物构效关系报道资料尚不多，今后需更加深入研究，获得大量数据，以总结其构效相关的规律性。

　　5 讨论

　　Rh2的体内、体外实验已初步证实具有抑制癌细胞的繁殖与生长。其作用机理被认为是再分化诱导作用;而非度癌细胞的直接杀伤作用。并证明其毒性甚低。由于其纯品得量甚少，几乎局限于体外的细胞培养，缺少大动物的体内实验数据，至于其临床疗效尚无报道，需今后加强此方面的研究。

　　根据我国人参地上部位的资源优势，以利用总皂苷或人参二醇组皂苷为原料，在适宜的反应条件下进行分子结构的化学修饰，作为抗癌新药，以实验室规模进行生产是有前途的。另外，寻求资源丰富的植物，从中提取、分得先导化合物，研究在生产中可行的合成路线，半合成Rh2也是可能的。

　　开发Rh2的难题之一，由于得量少。不能口服。况且口服后经胃酸水解变成配基，其活性大为降低。因此必须制成针剂。由于其水溶性甚差，几乎不溶于水，难以静脉用药。对此难题作者曾与日本金译医科大学病理学教研室小田岛肃夫教授和太田隆英讲师联系，他们给予大力支持，获得极大地启示。

　　由于Rh2得量甚少，体外细胞培养的抑瘤实验报道较多，如日本大阪大学北川勋教授曾经从红参中分得微量的20(S)-人参皂苷-Rh2(0.001%)，20(S)-人参皂苷-Rh1(0.006%)及20(R)-人参苷–Rh2(0.007%)，他与小田岛肃夫教授合作，做了大量有关–Rh2的基础研究工作。国内学者对–Rh2的研究虽起步较迟，但对动物体内实验报道较多，且将Rh2制成复方制剂，作为抗癌新药进行系统研究，做了大量的新药开发工作。