人参皂甙单体Rh2 对人K562白血病细胞增殖和凋亡的时效和量效分析

　　摘要 目的: 观察人参皂甙单体Rh2 对人K562 细胞增殖和凋亡的影响, 分析该影响的时间和剂量依赖性。

　　方法: 实验于2006-07 / 08 在吉林医药学院临床检验系实验室完成。①取对数生长期人K562 细胞制成细胞悬液, 浓度1×108L- 1, 接种于96 孔培养板内, 每孔100μL, 6h 后加入终质量浓度分别为6.25 , 12.5 , 25.0 , 50.0 ,100.0 mg / L 的人参皂甙单体Rh 2100μL ( 购自吉林省宏久生物科技股份有限公司) , 每一浓度组均设4 孔。对照孔及调零孔加100μL 培养液。各孔总体积均为200 μL。在加药后48 h 采用四甲基偶氮比色法检测各孔中细胞的抑制率。在接近于半数抑郁浓度的人参皂甙单体Rh 2 处理作用于细胞6 , 12 , 24 , 48 和72 h 后采用四甲基偶氮唑盐比色法计算抑制率。②在倒置显微镜下观察加药与未加药孔K562 细胞形态。③常规苏木精-伊红染色, 检测25.0 mg / L 人参皂甙单体Rh 2 作用0 , 12 , 24 和48 h 后K562 细胞的凋亡率, 并观察人参皂甙单体Rh 2 质量浓度分别为0 , 12.5 ,25.0 , 50.0 , 100.0 mg / L 时, 培养24 h 后的细胞凋亡率。

　　结果: ①人参皂甙单体Rh 2 对K562 细胞生长抑制作用: 当人参皂甙单体Rh 2 质量浓度为6.25 , 12.5 , 25.0 , 50.0 和100.0 mg / L 时, 抑制率逐渐升高,呈现明显剂量依赖性。人参皂甙单体Rh 2 对K562 细胞的半数抑制浓度为25.8 mg / L, 处理K562 细胞6 , 12 , 24 , 48 , 72 h 后细胞抑制率逐渐升高,且后4 个时间点明显高于处理6 h 时( t=11.79～50.89,P < 0.01 ) 。②人参皂甙单体Rh 2 对K562 细胞形态的影响: 细胞经人参皂甙单体Rh2 作用后呈现出明显的凋亡细胞形态, 细胞分散, 体积缩小, 胞浆浓缩, 细胞核膜消失, 细胞核断裂呈小块或碎片状, 但细胞膜较完整并可见凋亡小体。③人参皂甙单体Rh 2 对K562 细胞凋亡的影响: 在25.0 mg / L 人参皂甙单体Rh 2 作用K562 细胞0 , 12 , 24 和48 h 后, K562 细胞的凋亡率依次升高, 分别为( 3.8±0.5 ) % , (9.4±1.1)% , (23.2±2.2)% 和(34.5 ±3.5)% ( 与作用0 h 比较,t=8.78～20.06,P < 0.05～0.01 ) 。人参皂甙单体Rh 2 质量浓度分别为0 , 12.5 ,25.0 , 50.0 , 100.0 mg / L 培养K562 细胞24 h , 细胞凋亡率依次升高, 分别为[(3.7±0.6)%,(9.4±1.3)%,(21.2±2.1)%,(28.5±2.5)%,(31.8±3.4)%, 与0 mg / L人参皂甙单体比较, t=9.39～18.54,P < 0.01]。

　　结论: 人参皂甙单体Rh 2 能抑制体外培养的K562 细胞增殖并诱导其凋亡, 且呈时间和剂量依赖性。

　　主题词: 人参皂甙/ 药理学; K562 细胞/ 药物作用; 细胞凋亡; 细胞, 培养的

　　0 引言

　　现代医学研究表明, 中药人参具有抗肿瘤、抗衰老、抗辐射等多种生物活性作用, 其主要活性成分人参皂甙能诱导肿瘤细胞分化和凋亡而发挥抗肿瘤作用。人参皂甙单体Rh2 是一种原人参三醇型皂甙, 是红参的主要抗癌成分。作者以人红白血病K562 细胞株为受试对象, 研究人参皂甙单体Rh2 对K562 细胞增殖和凋亡的影响, 为进一步阐明人参皂甙单体抗白血病作用的机制, 从而为其应用于白血病的临床治疗提供更多的实验依据。

　　1 材料和方法

　　设计: 观察对比实验。

　　单位: 吉林医药学院临床检验教研室。

　　材料: 实验于2006 - 07 / 08 在吉林医药学院临床检验系实验室完成。人红白血病K562 细胞株( 购自中国科学院上海生物细胞研究所) ; 人参皂甙单体Rh2( 购自吉林省宏久生物科技股份有限公司) , 溶于PBS(pH 7.4) 中配成50 g / L 母液, 超滤除菌, - 20 ℃保存;RPMI - 1640 培养基( 购于美国Gibco 公司) ; 小牛血清(FBS)( 杭州四季青生物工程公司产品) 。

　　仪器: 超净工作台( 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司) 、CO2 培养箱( 上海易亮医疗器械有限公司) 、96 孔细胞培养板( 广州展晨生物科技有限公司) 、倒置显微镜、酶联免疫检测仪等。

　　设计、实施、评估者: 设计为第一作者, 干预实施为第一、二作者, 评估为第三、四作者, 均受过专业培训, 采用盲法评估。

　　方法：

　　细胞培养: K562 细胞用含120 g / L 小牛血清的培养液( 含1 ×105IU / L 青霉素和0 . 1 g / L 链霉素) , 于37 ℃, 体积分数0.05 CO2 恒温培养箱中培养, 细胞呈悬浮生长, 达80% 左右时传代。

　　药物处理: 细胞传代后, 接种于96 孔培养板内,当细胞为50%～60% 时, 换用含有不同浓度人参皂甙单体Rh2 的培养液。培养至预定时间后进行观测。

　　观察人参皂甙单体Rh2 对细胞生长的抑制作用:取对数生长期细胞制成细胞悬液, 浓度1 ×105L- 1, 接种于96 孔培养板内, 每孔100 μL, 6 h 后加入不同浓度的人参皂甙单体Rh2, 使终浓度分别为6.25 , 12.5 ,25.0 , 50.0 和100.0 mg / L, 每一质量浓度组均设4 孔。对照孔及调零孔加100 μL 培养液。各孔总体积均为200 μL。分别在加药后6 , 12 , 24 , 48 和72 h 采用四甲基偶氮唑盐比色法检测各孔中细胞的抑制率。用酶联免疫检测仪在570 nm 波长下测各孔的吸光度(A 值),按下列公式计算抑制率[( 1- 给药孔平均A 值/ 对照孔平均A 值)×100%]。具体步骤见参考文献。根据不同浓度下的抑制率绘制量效曲线, 由此计算出半数抑制浓度值。上述实验共重复6 次。

　　细胞光镜形态学观察: 在倒置显微镜下观察各组细胞并拍照。

　　人参皂甙单体Rh2 诱导凋亡的时效关系: 取25 . 0 mg / L (半数抑制浓度的近似值)人参皂甙单体Rh2分别作用0 , 12 , 24 , 48 h 后, 分别收集各组细胞, 制备细胞涂片, 常规苏木精- 伊红染色, 检测各组细胞凋亡率。计数3 次, 取平均值。

　　人参皂甙单体Rh2 诱导凋亡的量效关系: 设计人参皂甙单体Rh2 浓度分别为0 , 12 . 5 , 25 . 0 , 50 . 0 ,100.0 mg / L 5 个组。培养24 h 后分别收集各组细胞,检测各组细胞凋亡率。计数3 次, 取平均值。

　　主要观察指标: ①不同质量浓度人参皂甙单体Rh2 对K562 细胞生长的抑制率。②倒置显微镜下观察凋亡细胞的形态。③人参皂甙单体Rh2 不同作用时间后K562 细胞的凋亡率。④不同浓度人参皂甙单体Rh2作用后K562 细胞的凋亡率。

　　统计学分析: 由第一作者采用SPSS 11.0 软件包完成统计学处理。计量资料差异比较采用t 检验, 所有数据用x±s 表示。

　　2 结果

　　2.1 人参皂甙单体Rh2 对K562 细胞生长的抑制作用

　　K562 细胞的抑制率对人参皂甙单体Rh2 的质量浓度有明显依赖关系, 当人参皂甙单体Rh2 质量浓度分别为6 . 25 , 12 . 5 , 25 . 0 , 50 . 0 , 100 . 0 mg / L 时, 抑制率逐渐升高, 采用SPSS 统计软件进行曲线拟合, 计算出人参皂甙单体Rh2 对K562 细胞的半数抑制浓度为25 . 0 mg / L( 见图1 )。质量浓度为25 . 0 mg / L 的人参皂甙单体Rh2 作用不同时间K562 细胞的生长抑制率见表1 。

　　由表1 可见, 随着作用时间延长, K562 细胞生长抑制率逐渐增加。

　　2.2 凋亡K562 细胞形态

　　在倒置显微镜下可以观察到对照组K562 细胞体积大, 多呈圆形, 核圆形或椭圆形, 核浆比例大, 胞浆内未见颗粒, 常聚集生长; 随着人参皂甙单体Rh2 质量浓度的增加实验孔凋亡的K562细胞逐渐增多且更加明显。部分细胞呈现典型的凋亡细胞形态学改变, 细胞分散, 体积缩小, 胞浆浓缩, 细胞核膜消失, 细胞核断裂呈小块或碎片状, 但细胞膜较完整并可见凋亡小体, 见图2 。

　　2.3 人参皂甙单体Rh2 诱导K562 细胞凋亡的时效性

　　由表2 可见, 在25.0 mg / L 人参皂甙单体Rh2 作用下,K562 细胞凋亡率随作用时间延长而呈现递增的趋势。

　　2.4 人参皂甙单体Rh2 诱导K562 细胞凋亡的剂量关系

　　由表3 可见, K562 细胞凋亡率随人参皂甙单体Rh2 浓度的增加而呈现递增的趋势。

　　3 讨论

　　人参皂甙单体Rh2 是由人参中提取的天然活性成分, 脂溶性毒性低, 分子量小, 经不同途径而抑制多种肿瘤细胞株的生长, 但对K562 细胞的生长是否有抑制作用尚不明确。为此, 作者采用四甲基偶氮唑盐法进行了初步探讨, 结果显示人参皂甙单体Rh2 能抑制K562 细胞生长, 且这种抑制作用具有一定的剂量依赖性和时间依赖性。人参皂甙单体Rh2 对K562 细胞的半数抑制浓度为25.0 mg / L。随着人参皂甙单体Rh2 质量浓度增加和作用时间延长, K562 细胞的存活率逐渐下降。

　　从本文结果可见, K562 细胞经过人参皂甙单体Rh2 作用以后, 在倒置显微镜下呈现出明显的凋亡形态, 细胞缩小、彼此分散、核碎裂呈小块、胞浆浓缩、形成明显的凋亡小体。表明人参皂甙单体Rh2 能诱导K562 细胞凋亡, 且凋亡率随作用时间延长而呈现递增的趋势。

　　苏木精- 伊红染色显示, 正常细胞核均匀着色呈淡蓝色或蓝色, 未见凋亡小体。人参皂甙单体Rh2 作用以后细胞体积缩小、核固缩、碎裂、深染、部分裂解形成凋亡小体。

　　Andrews 等认为, 细胞凋亡是由正常的细胞周期改变引起的, 细胞凋亡与细胞周期阻滞有关, 细胞阻滞于哪一期, 凋亡就发生在哪一期。现代药理学研究证实, 人参中含有多种具有抗肿瘤作用的皂甙, 它们能诱导细胞凋亡及引起细胞周期阻滞, 从而抑制肿瘤生长。Kim 等研究表明, 人参皂甙单体Rh2 通过激活Caspase - 1 和- 3 及上调基因Bax 而诱导人神经母细胞瘤凋亡的作用。Cheng 等研究表明, 人参皂甙单体Rh2 有阻滞人肺腺癌细胞A549 于G1 期并诱导其凋亡的作用。本文结果表明, 在一定范围内, 凋亡细胞所占比例呈现出随人参皂甙单体Rh2 浓度增加及作用时间延长而递增的趋势。但50.0 mg / L 组与100.0 mg / L 组凋亡率差异无显著性( P > 0.05 ) , 说明人参皂甙单体Rh2 达一定质量浓度后, K562 细胞的凋亡率不再随药物浓度的增加而进一步增加。这可能是由于细胞凋亡是一种在严格的程序性控制下发生的细胞死亡形式,外界刺激通过信号传递系统到达细胞内是启动凋亡的必要条件, 随后在一定的内部程序控制下即通过细胞的中央调控使细胞出现凋亡的形态学改变, 当人参皂甙单体Rh2 的质量浓度达一定值后, 凋亡率不再随药物浓度增加而增加, 但具体诱导机制还有待于进一步研究。

　　肿瘤的发生、发展与细胞凋亡异常有密切的关系。许多抗肿瘤药物都可诱导或促进肿瘤细胞凋亡而发挥治疗作用。Jia 等研究表明, 人参皂甙单体Rh2 能增加多药耐药细胞株对化疗的敏感性。本实验显示人参皂甙单体Rh2 有抑制人K562 细胞增殖并诱导其凋亡的作用, 从而为开发出一种抗白血病新药提供进一步的实验依据。