端粒酶在人参皂甙Rh_2诱导肝癌细胞分化中的作用

　　【摘要】 背景与目的：最近我们研究发现，终浓度为20μg/mL的人参皂苷单体Rh2对人肝癌细胞株SMMC-7721有诱导分化作用，但其作用机制有待进一步研究。一些研究表明端粒酶再激活可能在细胞的癌变和永生过程中发挥中药作用。本研究从端粒酶调控方面探讨G-Rh2诱导SMMC-7721分化的作用机制。方法：采用TRAP-PCR-ELISA法定测量20μg/mL G-Rh2处理SMMC-7721细胞后端粒酶活性，RT-PCR法检测细胞内端粒酶催化亚单位(human telomerase reverse teansciptase， hTERT)和p21 mRNA的表达，以流失细胞仪检测药物作用前后细胞周期的改变和细胞内Cyclin D1、Cyclin E和P16蛋白水平。结果：G-Rh2呈时间依赖性抑制SMMC-7721细胞端粒酶活性，20μg/mL G-Rh2处理细胞1天后，端粒酶活性从1.105下降到0.765(P<0.01);而作用细胞5天后，活性从1.152下降到0.326(P<0.01)。20μg/mL G-Rh2能抑制细胞hTERT mTNA 表达。20μg/mL G-Rh2使G1期细胞增多，S期和G2/M期细胞减少;处理细胞24h后，G1期细胞升高最明显，从60.85%增高到78.53%(P<0.01)。20μg/mL G-Rh2可诱导细胞周期抑制因子Cyclin D1和Cyclin E表达。结论：hTERT mRNA表达水平和细胞周期的进程与端粒酶的活性密切相关，抑制端粒酶活性可能是G-Rh2发挥诱导分化的机理之一。

　　关键词： 人参皂苷Rh2;肝细胞癌; 端粒酶; 细胞周期

　　中图分类号：R979.1 文献标识码：A

　　文章编号：1000-467X(2004)12-1655-05

　　人参(Panax ginseng C.A meyer)为五加科多年生草本植物，是已有近几千年应用历史的名贵中药。人参皂苷是人参中主要的活性有效成分。我们曾研究发现人参总皂苷在体外能诱导人肝癌细胞株HepG2分化，最近我们又研究发现人参皂苷单体Rh2(ginsenoside Rh2,G-Rh2)对人肝癌细胞株SMMC-7721有诱导分化作用，对其作用机制有待进一步研究。端粒酶是一种RNA依赖性核酸蛋白复合体，以自身的RNA为模版，不断合成端粒重复序列加到端粒末端，以弥补细胞分裂丢失的端粒片段。越来越多的研究发现，端粒酶的激活与恶性肿瘤的形成和发展密切相关。因此，我们研究G--Rh2诱导SMMC-7721肝癌细胞分化过程中端粒酶催化亚单位(human telomerase reverse teansciptase， hTERT)mRNA表达情况，并且研究G-Rh2对SMMC-7721细胞周期及周期相关调节因子的影响，探讨端粒酶亚单位，细胞周期、诱导分化与端粒活性调节的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　人肝癌细胞株SMMC-7721引自重庆大学生物工程系;G-Rh2由白求恩医科大学有机化学教研室提供，纯度95%。RPMI-1640培养基为Gibco公司产品，小牛血清为杭州四季青公司产品，端粒酶PCR-ELISA测定试剂盒购自Boehringen Mannheim 公司。小鼠抗人Cyclin D1单抗、小鼠抗人P16单抗、兔抗人Cyclin E多抗购自Santa Cruz公司;FITC标记山羊抗小鼠IgC、FITC标记山羊抗兔IgC购自Santa Cruz公司;FITC标记山羊抗小鼠IgC、FITC标记山羊抗兔IgC购自北京中山生物技术有限公司;RNA提取试剂为Boehringen Mannheim 公司产品;RT-PCR试剂购自伤害生工生物工程技术服务有限公司。

　　1.2 细胞培养

　　SMMC-7721细胞生长在含10%热灭活小牛血清、100μ/ml青霉素及100μg/ml 链霉素的RPMI-1640培养基中，置5%CO2、37℃恒温密闭式孵箱培养传代。

　　1.3 端粒酶活性测定

　　参考端粒酶检测试剂盒说明操作。用终浓度为20μg/ml的G-Rh2处理细胞1、3、5天后，分别制备端粒酶提取液。同时，取对照细胞提取液加入终浓度为20μg/ml的G-Rh2作为30、60min后检测端粒酶活性。RT-PCR扩增：取上述提取液加入PCR反应混合液，共50μl反映体系(包括dNTP、Taq酶、生物素标记的引物Ι和引物Ⅱ)，25℃逆转录30min;94℃灭活5min;94℃ 30s，50℃ 30s，72摄氏度 90s，循环30次;72℃ 10min。ELISA法检测扩增产物;取5μl扩增产物，加20μl变性试剂，室温(25℃)孵育10min，加入225μl杂交混合液(含地高辛标记的检测探针)，充分混匀后，转100μl混合液于抗生物素蛋白包被的微孔板上，37摄氏度床杂交2h，然后加过氧化物酶标记的抗地高辛抗体100μl，室温下孵育30min，最后加入100μl四甲基苯胺(3,3‘,5,5‘-tetramethy benzidine,TMB)显色10min，加5%硫酸终止反应，测定450nm和690nm的吸光度值(A值)。根据A=A450-A690计算，A值代表端粒酶活性。对细胞提取液进行65℃热处理10min作为阴性对照;恒表达端粒酶活性的293细胞抽提物(试剂盒内备有)作为阳性对照。

　　1.4 RT-PCR法检测hTERT和p21 mRNA表达

　　用终浓度20μg/ml的G-Rh2处理SMMC-7721细胞0、12、24、72h后，参照TripureTM提取试剂说明书提取细胞总RNA，用RT-PCR法检测各组细胞hTERT和p21mRNA表达水平。hTERT引物序列为：5‘-CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA-3‘，5‘-GGATGAAGCGGAGTGGA-3‘，预期片段长度为145bp。P21引物序列为：5‘-TTAGGGCTTCCTCTTGGAGAAGAT-3‘;5‘-ATGTCAGAACCGGCTGGGGATGTC-3‘，预期片段为495bp。Β-actin引物序列为：5‘-ACACTGTGCCCATCTACGAGG-3‘;5‘-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3‘，预期片段长度为621bp。PCR扩增条件：94℃ 5min;94℃ 1min，60℃ 30s，72℃1min，30个循环; 72摄氏度10min。用数字化凝胶成像分析软件对RT-PCR电泳结果进行半定量分析，根据hTERT、P21与相应β-actin条带光密度(OD)值只比计算相对含量，作为半定量指标。

　　1.5 细胞周期分析

　　将未处理和经终浓度为20μg/ml G-Rh2处理的SMMC-7721细胞分别培养24、48、72h后，收集细胞，用PBS洗涤细胞2次，碘化丙啶避光染色，在流式细胞仪上分析细胞周期。

　　1.6 Cyclin D1、Cyclin E和P16蛋白表达分析

　　参考Yano等检测细胞内蛋白质方法：用终浓度为20μg/ml的G-Rh2处理细胞0、12、24、72h后，流式细胞仪检测SMMC-7721细胞Cyclin D1、CyclinE 和P16蛋白的表达，三种蛋白表大量荧光强度指数(fluorescense intensity index，FI)表示，并计算变化率，变化率=(fluorescence intensity index FI)/实验对照细胞的FI×100%。

　　1.7 统计学处理

　　以SPSS10.0 软件进行统计学分析。

　　2 结果

　　2.1 G-Rh2对SMMC-7721细胞端粒酶活性的影响

　　如表1所示，SMMC-7721细胞培养1、3、5天后端粒酶活性无明显改变。提示G-Rh2处理 细胞1、3、5天后，端粒酶活性逐渐降低(P<0.01)。用20μg/ml G-Rh2直接作用SMMC-7721细胞提取液，端粒酶活性无明显改变。提示G-Rh2能抑制肝癌细胞端粒酶活性，但并无直接抑制作用。

　　2.2 G-Rh2对SMMC-7721细胞hTERT和p21mRNA表达水平的影响

　　从图1可见，对照细胞有hTERT mRNA表达，但几乎检测不出p21 mRNA 表达迅速下降，甚至没有表达;但p21 mRNA表达量随G-Rh2作用时间延长而增加。结果表明G-Rh2能抑制SMMC-7721细胞内hTERT mRNA表达，诱导细胞内p21 mRNA表达。

　　2.3 G-Rh2对SMMC-7721细胞周期的影响

　　由表2、图2可见，与对照组相比，20μg/ml G-Rh2使G0/G1期细胞增多，S期和G2/M期细胞减少，且影响程度与作用时间有关，以G-Rh2处理细胞24h后，G0/G1期百分比升高最明显(P<0.01)。

　　2.4 G-Rh2对SMMC-7721细胞Cyclin D1、Cyclin E和P16蛋白表达的影响

　　由表3可见，对照细胞Cyclin D1蛋白表达较Cyclin E强;20μg/ml G-Rh2作用细胞24h后，Cyclin D1、Cyclin E 蛋白表达量降低，P16蛋白表达量升高。并且随作用时间延长，这种变化更加明显。结果表明G-Rh2能诱导P16蛋白表达，抑制Cyclin D1、Cyclin E蛋白表达。

　　3 讨论

　　目前，细胞诱导分化对肿瘤细胞端粒酶活性的调节还不十分清楚。研究表明多种分化诱导剂在诱导白血病、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等细胞株分化的同时，可使端粒酶活性下降。然而，在诱导黑色素瘤CM73-36细胞和神经胶质瘤Ast812细胞分化中，无端粒酶抑制现象。说明不同分化诱导剂对端粒酶活性的影响不同，这可能与不同的细胞株有关，因为不同的细胞有各自的癌变机制。本研究发现SMMC-7721肝癌细胞株端粒酶活性高表达，20μg/ml G-Rh2在诱导肝癌细胞分化过程中，可明显抑制端粒酶活性，并且随着细胞分化的进行，端粒酶活性进行性下降。但发现20μg/ml G-Rh2对细胞内端粒酶活性并无直接抑制作用。结果提示G-Rh2对SMMC-7721细胞端粒酶活性的调节可能是其发挥抑制细胞增殖、诱导分化作用的一个重要方面，是细胞分化过程说伴有的。

　　研究表明hTERT基因表达与端粒酶活性呈高度相关性，hTERT在端粒酶活性调节中起关键作用。研究证实分化诱导剂在诱导肿瘤细胞分化的同时，可抑制hTERT mRNA表达而使端粒酶活性下降。然而，Lin等报道抗癌剂使淋巴瘤使淋巴瘤细胞端粒酶活性下降，hTERT mRNA 及蛋白表达却增加。说明端粒酶调控非常复杂，某些调节途径并不会影响hTERT m RNA高表达，20μg/ml G-Rh2抑制细胞hTERT mRNA表达与G-Rh2抑制细胞端粒酶活性的结果完全一致。提示hTERT mRMA 可能直接参与肝癌端粒酶活性调节;分化诱导剂G-Rh2可能通过影响端粒酶活性催化亚单位m RNA表达来抑制端粒酶活性。

　　端粒酶活性的调节具有细胞周期依赖性。研究发现维生素D类化合物诱导前列腺癌、乳腺癌、白血病细胞分化时，细胞阻滞于G0/G1期，伴端粒酶活性明显下降。Hsieh等研究发现，肝癌中由于Cyclin D1 和周期素依赖性激酶等调控蛋白的异常表达而导致细胞周期失调，可引起端粒酶的激活。本研究发现20μg/ml G-Rh2使SMMC-7721细胞增殖阻滞于G0/G1期;细胞周期正调节因子Cyclin D1和Cyclin E表达减弱，负调节因子P16、P21表达增强;并且随着处理时间延长，G-Rh2对细胞周期调控因子的影响越明显。这与G-Rh2时间依赖性降低端粒酶活性完全一致。结果提示端粒酶的活性与细胞周期关系密切;分化诱导剂G-Rh2可能通过诱导细胞周期负调节因子表达，下调正调节因子表达，从而阻止细胞周期进程，最终抑制端粒酶活性。但目前端粒酶活性调节与细胞周期之间的因果关系尚无定论，还需深入研究。

　　综上所述，端粒酶活性的调节是一个复杂的过程，与许多因素有关，存在着多种不同的途径。G-Rh2在诱导SMMC-7721细胞分化时，可能通过调控以上因素而达到对端粒酶活性的抑制作用;抑制端粒酶活性可能是G-Rh2诱导肝癌细胞分化的机制之一。