人参皂苷Rh2对人肝癌细胞SMMC—7721的诱导分化作用

　　【摘要】背景与目的：目前寻找低毒高效的分化诱导剂是肿瘤诱导分化治疗的关键。人参具有抗肿瘤、抗衰老、抗辐射等多种生物学活性，其主要的活性有效成分人参皂苷Rh2具有较强的抗癌活性，但其抗肿瘤机制还不十分清楚。因此，本研究探讨G—Rh2对人肝癌细胞株SMMC—7721的生长抑制作用及抗癌机制。 　

　方法：以MTT法、光镜、电子显微镜观察G—Rh2对SMMC—7721细胞增殖、形态、超微结构的影响。用免疫组化染色和ELISA法检测细胞浆中甲胎蛋白(APF)合成情况，酶促反应试剂盒检测细胞浆中碱性磷酸酶(ALP)和y 谷氨酰转肽酶活性，放射免疫法检测细胞AFP和白蛋白(Alb)分泌量，并观察G—Rh2对以上指标的影响。

　　结果：G—Rh2以时间依赖性和浓度依赖性抑制SMMC—7721 细胞增殖，10 ug/ml G—Rh2作用6天抑制率达50%;而20 ug/ml G—Rh2作用4天抑制率近50%。经20 ug/ml G—Rh2用4天，肝癌细胞形态及亚细胞结构向正常肝细胞方向逆转。10 ug/ml G—Rh2、20 ug/ml G—Rh2作用SMMC—7721细胞后AFP合成明显下降(p<0.05)， 分泌量从6.60±0.30下降到2.35±0.06( p<0.01);y—GT及耐热型ALP活性显著降低(p<0..01);ALP活性及Alb分泌量显著升高(p<0.01)。

　　结论G—Rh2具有诱导人肝癌细胞SMMC—7721 向正常细胞分化的作用。

　　关键词：人参皂苷Rh2;肝细胞癌;细胞分化

　　诱导恶性肿瘤细胞向正常表型分化是肿瘤治疗的新途径之一，寻找低毒高效的分化诱导剂是诱导分化治疗的关键。人参为五加科多年生草本植物，是已有几千年应用历史的名贵中药。现代医学表明，人参具有抗肿瘤、抗衰老、抗辐射等多种生物学活性。人参皂苷是人参中主要的活性有效成分。以往对人参皂甙诱导分化作用的研究大多局限于白血病细胞、畸胎瘤细胞、卵巢癌细胞以及黑色素瘤细胞，人参皂甙对人肝癌细胞作用的研究则少见报道。我们曾研究发现人参总皂苷在体外能诱导人肝癌细胞株HepG2分化，但人参总皂苷成分较复杂且作用各不相同，甚至作用截然相反，而人参皂甙单体Rh2作用专一，具有较强的抗癌活性。本研究以人肝癌细胞株SMMC—7721为靶细胞，观察G—Rh2在体外对该细胞的诱导分化作用。

　　1 材料与方法

　　1.1材料

　　人肝癌细胞株SMMC—7721引自重庆大学生物工程系G—Rh2由白求恩医科大学有机化学教研室提供，纯度>95%;RPMI—1640培养基为Gibeo公司产品;小牛血清为杭州四季青公司产品;鼠抗人甲胎蛋白(AFP)抗体购自北京中山生物技术有限公司;SABC试剂盒购自北方同正生物技术发展公司;AFP、白蛋白(Alb)放免测定盒购自中国原子能科学研究院;碱性磷酸酶和y谷氨酰转肽酶检测试剂盒均购自上海长征医学科学有限公司。

　　1.2细胞培养

　　SMMC—7721细胞生长在含10%热灭活小牛血清、20 ug/ml青霉素及100 ug/ml链霉素的RPMI—1640培养基中，置5% 二氧化碳，37℃恒温密闭式孵箱内培养传代。

　　1.3 MMT法

　　细胞用0.25%胰酶消化成细胞悬液接种于96孔板，在5% 二氧化碳，37℃培养箱培养一天后换液，从第二排起各排加G—Rh2，浓度梯度依次为5、10、20、40 ug/ml，每个浓度组及对照组、空白试剂组均做G个平行孔，每两天换液一次，处理2天、4天、6天后用MTT法测定波长为570mm 处各孔的吸光度(A)值。细胞生长抑制率=(1—处理组吸光度/对照组吸光度)x 100% 。

　　1.4细胞形态

　　生长在盖玻片上经10ug/ml、20ug/ml、40ug/mlG—Rh2处理4天及相应对照细胞，均经原位固定、瑞氏染色后光镜下观察。将20ug/mlG—Rh2处理4天及相应对照组细胞，按常规方法制备超薄切片，透射电镜观察亚细胞结构。

　　1.5 样品制备

　　将10、20 ug/mlG—Rh2分别处理2天、4天、6天及相应对照组细胞用0.25%胰酶消化，2 000r/min离心10min后，用冷PBS洗涤3次，加入预冷的0.25%脱氧胆酸钠溶解细胞4℃静置30min，再4℃ 12 000 r/min离心20min，收集上清液供测定，-70℃保存备用。

　　1.6酶活性及细胞内AFP测定

　　将样品按试剂盒说明测y—GT和ALP活性;耐热型ALP(胎盘型)活性的测定于65℃加热30min后，测定剩余酶活力占总活力的百分比;细胞内AFP测定包括上清液包被及常规ELISA法检测。总蛋白质含量用考马斯亮蓝法测定。

　　Y—GT(或ALP)比活力(IU/g)=y-GT(或ALP)值/总蛋白量。

　　1.7细胞内APF的免疫组化检测

　　将生长在盖玻片上经20ug/mlG—Rh2处理2天、4天、6天及相应对照组细胞取出，PBS洗6次，晾干;冷丙酮固定10min，25℃，阴性对照用PBS替代第一抗体，PBS洗6次，晾干;按SABC试剂盒说明进行常规免疫组化染色，封片后光镜下观察。

　　1.8 AFP和Alb分泌量测定

　　收集经10、20ug/ml G—Rh2处理2天、4天、6天及相应对照组的培养液，4 000离心5min，取上清冷冻干燥。细胞消化后台盼蓝拒染法计数活细胞数。将干燥后的培养液溶于PBS中，用放射免疫法测定AFP和Alb的含量。

　　1.9统计学方法

　　处理组与对照组比较采用t检验。

　　2结果

　　2.1G—Rh2对SMMC—7721细胞增殖的抑制作用MTT法测定结果显示G—Rh2对SMMC—7721细胞有生长抑制作用，并呈浓度和时间依赖关系(见表1)。提示5、10、20、40ug/ml为有效药物浓度，而空白试剂对细胞生长无影响。

　　2.2 G—Rh2对细胞形态影响

　　光镜下发现经20um/ml G—Rh2处理4天的SMMC—7721细胞形态由原来的卵圆形、多边形，贴壁叠堆状生长转变为长梭形或树枝状，有突起伸出，细胞叠堆状明显减少，细胞互相分散。细胞核变小，固缩而深染，染色质凝集，核仁数目变少，胞浆浓缩而深染，核浆比例降低。经5、10 um/ml G—Rh2处理后的细胞形态变化不明显，经40 um/ml G—Rh2处理后的细胞出现坏死。电镜下观察发现对照组SMMC—7721细胞核大而圆，染色质疏松，核仁明显，细胞质较少，，细胞器都比较简单，糖原增生活跃，可见分裂相，高尔基复合体不发达，难以见到。20 ug/ml G—Rh2处理4天后，细胞核变小、皱缩，染色质凝集，异染色质增多，核仁不明显。细胞质增多，线粒体数量增多，粗面内质网、游离核蛋白体增多，高尔基复合体体积增大、发育较完善，易于发现。糖原增生程度较轻。提示SMMC—7721细胞趋于成熟分化。

　　2.3 G—Rh2细胞对SMMC—7721细胞y—GT活性的影响

　　各药物处理组细胞y—GT比活力逐渐下降，较对照有显著性降低(P<0.01)。而10 ug/ml、20 ug/mlG—Rh2处理组之间有显著性差异(p<0.01)，提示G—Rh2降低y—GT的活性有明显的量效关系。

　　2.4 G—Rh2对SMMC—7721细胞ALP活性及耐热型同工酶活性的影响

　　如表3所示，ALP比活力在培养过程中逐渐升高，各药物处理组ALP比活力均明显高于对照(p<0.01)，而10、20ug/ml G—Rh2处理组之间有显著性差异( p<0.05);如表4所示，各药物处理组ALP耐热型同工酶即胎盘型ALP活性显著低于对照( p<0.01)，而10、20ug/mlG—Rh2处理组之间有显著性差异(p<0.01)。提示G—Rh2对升高ALP活性及降低耐热型同工酶活性的影响呈明显的浓度依赖关系。

　　2.5 G—Rh2对SMMC—7721细胞内AFP的影响细胞免疫组织化学结果显示，SMMC—7721细胞浆中AFP染色呈棕黄色。对照细胞中AFP主要成团浓集分布于胞浆中，着色较深。20ug/mlG—Rh2处理SMMC—7721细胞后，AFP在胞浆内均匀分布，且着色较淡，尤其在药物作用4天后最为明显。

　　EILSA定量检测细胞内AFP结果显示，各药物处理组AFP量均低于对照，以第4天、第6天的抑制最明显(P>0.05)。而处理1.、20 ug/mlG—Rh2组之间在第4天、第6天有显著性差异(p<0.05)，提示G—Rh2对细胞内AFP的影响有明显的时效和量的关系。(表5)。

　　2.6 G—Rh2对SMMC—7721细胞AFP和Alb分泌的影响

　　如表6所示，对照组 AFP分泌量以第5天为最高p<0.01)，各药物处理组AFP分泌量明显低于对照组(P<0.01)，而10ug/ml、20 ug/ml G—Rh2处理组之间在第4天、第6天有显著性差异(P<0.05);如表7所示，各药物处理组Alb分泌量较对照组有显著性升高( P<0.01)，而10 ug/ml、20 ug/ml处理组之间有显著性差异(P<0.01)。提示G—Rh2对降低AFP和升高Alb分泌量呈明显的浓度依赖关系。

　　3 讨论

　　过去的研究已证明，一定浓度的人参皂苷Rh2能诱导多种恶性细胞的表型逆转，包括白血病细胞、畸胎瘤细胞等，说明G—Rh2对癌细胞的诱导分化作用可能具有比较普遍的意义，是一种有应用前景的癌细胞分化诱导剂。实验中吸光度值的大小可以反映活细胞的数量及代谢活性，因此应用#$$ 比色法可定量测定抗癌药物对人癌细胞的细胞毒活性和细胞生长

　　抑制情况。为了证实G—Rh2对SMMC—7721细胞是否具有直接的抑制作用，采用MTT实验观察不同浓度G—Rh2作用不同时间后，对人肝癌细胞增殖的影响，确定生长受到明显抑制的药物浓度和作用时间。本研究中MTT结果显示，10ug/ml G—Rh2能抑制细胞的生长，第6天抑制率可达到50%。并且G—Rh2对SMMC—7721细胞的抑制作用具有时间和浓度依赖性，随着G—Rh2作用时间的延长、浓度的升高，对SMMC—7721细胞的抑制作用增强。由此可见，G—Rh2可以直接作用于肿瘤细胞，抑制细胞的生长。

　　形态学上的分化成熟是表明恶性肿瘤细胞分化的标志。一般说来，恶性程度越高，分化越差的恶性肿瘤细胞内线粒体往往越少，线粒体内嵴发育越差。粗面内质网的量与癌细胞的生长速率、恶性程度成反比，而与其分化程度成正比。分化低和生长快的肿瘤细胞高尔基体发育差，而分化较好的恶性和良性肿瘤细胞高尔基体发育较好。糖原增生程度与癌细胞的无氧酵解代谢活动成正比，而与其分化程度成反比。本研究中，光镜、电镜观察的结果结合MTT实验发现20 ug/ml G—Rh2能明显抑制人肝癌细胞株SMMC—7721生长，并且细胞形态和超微结构发生了明显的变化，细胞已出现和能量代谢、蛋白质合成、贮存或分泌功能相关的发育分化。虽然MTT实验表明5、10、40 ug/ml G—Rh2也为有效药物浓度，但形态学方面发现5、10 ug/ml 时细胞变化不明显，40 ug/ml G—Rh2时细胞出现坏死。实验结果证实了20 ug/ml G—Rh2对SMMC—7721细胞形态上的分化作用，细胞器发育状态的改变及其形态结构向正常方向转变提示癌细胞恶性表型发生逆转。

　　为了探讨肝癌细胞分化的定量指标，本研究根据肝细胞的代谢特点，选用了几种反映肝细胞分化的特异性酶和蛋白为标志y—GT成年鼠肝中的活性极低，而在诱癌过程中逐渐上升，是肝癌变的早期标志。研究证明ALP可作为畸胎瘤和胰腺癌细胞的分化标志，肝癌患者出现耐热型ALP同工酶。本研究结果显示10 ug/ml 、20 ug/ml 均降低SMMC—7721细胞y—GT和耐热型ALP活性，而升高ALP总活性，并且呈明显的量效关系。AFP是公认的肝细胞增殖和恶变的重要标志物。细胞内AFP免疫组化检测和ELISA定量检测发现并不是所有的癌细胞均呈AFP阳性，对照组和G—Rh2处理组细胞AFP合成量都较低，且仅在G—Rh2处理4天、6天后AFP有显著降低。这些结果可能是处于不同细胞周期的细胞合成AFP量不同所致。过去研究证明AFP合成的高峰迟于DNA合成的高峰;在DNA合成开始后，细胞以指数增长时，AFP才开始合成。进一步发现AFP的合成出现在G2期，并于G2/M期或细胞分裂之后释放。本研究发现SMMC—7721细胞在10、20 ug/ml G—Rh2作用下，AFP分泌量明显减少，而作为肝细胞分化成熟指标的Alb分泌量则明显增多，并呈明显的剂量依赖关系。

　　总之，本研究结果揭示G—Rh2具有抑制SMMC—7721人肝癌细胞增殖和诱导分化的作用。至于G—Rh2使肿瘤细胞分化的作用机理尚不清楚，我们将对其作用机制、临床价值进行深入研究，为临床应用G—Rh2治疗肝癌及其它实体肿瘤提供实验依据。