人参皂苷Rh2 注射液对荷肝癌( H22) 小鼠免疫功能的影响

　　葛迎春,李晨燕,任慧君,马天舒,刘　平

　　(大连市中医研究所,大连116013)

　　作者简介:葛迎春(1961 - ) ,女,长春市人,副研究员,从事中药细胞药理学研究。

　　出自：特产研究Special Wild Economic Animal and Plant Research 2002年第3期

　　文章编号:1001 - 4721( 2002) 03 - 0004 - 04

　　【摘　要】:本研究以荷肝癌(H22) 小鼠为实验模型,观察人参皂甙Rh2 注射液对荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能、血清溶血素、NK细胞毒活性和IL - 2 免疫指标的影响。

　　结果表明:人参皂甙Rh2 注射液能提高荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能、增加血清溶血素抗体生成能力、促进小鼠脾NK细胞杀伤活性和IL - 2 活性。人参皂甙Rh2注射液明显提高荷瘤小鼠免疫功能。

　　关键词:人参皂甙Rh2 ;免疫功能;H22肝癌瘤株

　　中图分类号:R285. 5 　　　　文献标识码:A

　　人参具有广泛的药理作用,以往研究表明:人参能提高机体的免疫力[1 ] 。本研究以H22荷瘤小鼠为实验模型,进一步观察人参皂甙Rh2 注射液对荷瘤小鼠免疫功能的影响。

　　1 　材料和方法

　　1. 1 　动物

　　昆明种小白鼠60 只,体重20. 74 ±0. 77g ,雌雄各半,由大连市药品检定所动物实验基地提供;H22肝癌瘤株由中国医学科学院药物研究所肿瘤室提供;淋巴细胞(YAC - 1) 购自武汉大学

　　菌种保藏中心。

　　1. 2 　仪器和试剂

　　PRMI - 1640 培养基(Gibco ,USA) ;胎牛血清(FCS ,中国医学科学院血液研究所购进,批号:200004) ;曲拉通(Triton X100 ,Sigma) ;还原型辅酶I (CoI ,NADH ,Sigma) ;阳性对照药:环磷酰胺

　　(CP ,上海第十二制药厂,批号:011015) ;人参皂甙Rh2 注射液、无色透明液体,由吉林省中医中药研究院提供,批号: 010615 ; 鸡红细胞; Giemsa 染色液。CO2 培养箱(SANYO ,MCO - 175M,Japan) ;超净工作台(CJ - 1 ,苏州长桥净化设备厂) :紫外光度计(TU - 1221 ,北京瑞利分析仪器厂) ;自动酶标度仪(CliniBio ,EC) ;倒置显微镜(OLYPUS ,Japan) ;生物学显微镜;96/ 24 孔培养板(Costar ,USA) ;微量血凝计数板,离心机。

　　1. 3 　实验分组

　　实验随机分成6 组:正常对照组;无菌操作取荷肝癌(H22) 小鼠腹水,用0. 9 %生理盐水稀释至含1 ×107/ ml ,每只右腋皮下接种0. 2ml (2 ×106/ 只) 随机分成H22荷瘤对照组;H22阳性对照组(环磷酰胺,CP) ;H22人参皂甙Rh2 注射液高剂量组、中剂量组、低剂量组,每组10 只。

　　1. 4 　实验方法

　　1. 4. 1 　人参皂甙Rh2 注射液对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

　　给药方法: 小鼠接种瘤细胞24h 后开始给药, 正常对照组(注射等体积的生理盐水) ; H22荷瘤对照组(注射等体积的生理盐水) ; H22阳性对照组(腹腔注射CP ,20mg/ kg ×3 ,间隔3d 1次) ;H22人参皂甙Rh2 注射液高剂量组(40mg/ kg) 、中剂量组(20mg/ kg) 、低剂量组(10mg/ kg) ,每日静脉注射1 次,连续给药5d ,免疫动物后继续给药5d ,体积均为0. 1ml/ 只。细胞悬液制备:取鸡血置于有玻璃珠的锥形瓶中,朝一个方向充分摇动,以脱纤维,用生理盐水洗涤3 次,离心2000r/ min ,10min ,弃上清,用生理盐水配成20 %(V/ V) 的鸡红细胞悬液。

　　吞噬功能测定:末次给药后,次日清晨每只鼠腹腔注射20 %鸡红细胞悬液1ml ,轻柔腹部,30min 后,颈椎脱臼处死动物,立即开腹吸取腹腔液滴在玻片上约0. 2ml ,玻片置入37 ℃,孵育30min 后,再用生理盐水中漂洗,除去未贴片细胞,晾干,以1∶1 丙酮甲醇溶液固定,4 %(V/ V)Giemsa - 磷酸缓冲液染色3min ,蒸馏水漂洗晾干。

　　显微镜下结果判定:油镜下计数巨噬细胞,每张计数100 个,计算吞噬百分率和吞噬指数。

　　1. 4. 2 　人参皂甙Rh2 注射液对小鼠体液免疫的影响———血清溶血素测定血凝法SRBC:绵羊颈静脉取血,将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中,朝一个方向摇动,以脱纤维,放入4 ℃冰箱保存备用,可保存2 周。免疫动物及血清分离:取羊血,用生理盐水洗涤3 次,每次离心2000r/ min ,10min ,将压积SRBC 用生理盐水配成2 %(V/ V) 的细胞悬液,每只鼠腹腔注射0. 2ml 进行免疫,5d 后,摘除眼球取血于离心管中,放置约1h ,将凝固血与管壁剥离,使血清充分析出,2000r/ min ,10min ,收集血清。

　　凝集反应:用生理盐水将血清倍比稀释,将不同稀释浓度的血清分别置于微量试验板内,每孔100μl ,再加入100μl 0. 5 %(v/ v) 的SRBC 悬液,混匀,装入湿润的平盘内加盖,于37 ℃温箱孵育3h ,观察血球凝集程度。

　　1. 4. 3 　人参皂甙Rh2 对荷瘤小鼠NK细胞和IL - 2 活性影响[2 ,3 ]

　　1. 4. 3. 1 　接种方法和实验分组:同前。

　　1. 4. 3. 2 　给药方法:小鼠接种瘤细胞24h 后开始给药,每日注射1 次,连续给药10d。体积均为0. 1ml/ 只,于停药次日清晨断头处死小鼠,无菌取脾,检测NK细胞和IL - 2 的活性。

　　1. 4. 3. 3 　脾细胞悬液制备: 无菌取脾,放置在无血清的PRMI - 1640 培养液中,将脾剪成1mm3 ,用注射器芯研磨至单个细胞,过200 目尼龙网,1000r/ min 离心,10min ,按文献制备成细胞悬液,备实验用。

　　1 . 4. 3. 4 　NK细胞毒活性- 胞浆乳酸脱氢酶(LDH) 释放法:各实验组脾细胞为效应细胞0. 1ml (2 ×106 细胞/ 管) ,加淋巴细胞(YAC - 1) 悬液0. 1ml (2. 0 ×105 细胞/ 管) ,加小牛血清0.1ml ,补加培养液至1ml ,每组设5 个平行。自然释放管加YAC - 1 细胞悬液0. 1ml ,小牛血清0.1ml ,补加培养液0. 8ml 。最大释放管每管加YAC - 1 细胞悬液0. 1ml ,小牛血清0. 1ml ,补加1 %Triton - 1000. 8ml 。上各试验组置37 ℃,5 %CO2 的培养箱中,饱和湿度培养18h ,1000r/ min ,离心5min ,取全部上清液。加LDH 反应液3ml ,用分光光度计以340nm ,32 ℃恒温测定吸光度值。

　　1. 4. 3. 5 　IL - 2 的制备和活性检测: 　IL - 2 的诱生:无菌制脾细胞悬液方法同前,用PRMI -1640 培养液洗涤2 次,配成1 ×108 个/ ml 细胞悬液,每孔100μl ,加入96 孔培养板中,使每孔细胞为5 ×106 个。离心收集上清液,置- 20 ℃冰箱保存备用。制备活化的脾细胞悬液:无菌制脾细胞悬液方法同前,制成5 ×106 个/ ml 细胞悬液,加入ConA ,使其浓度为5μl/ ml ,置37 ℃,5 %CO2 饱和湿度培养48h ,收集细胞,离心2 次,重悬于PR2MI - 1640 培养液中,作为IL - 2 活性检测细丙。

　　IL - 2 活性检测:取- 20 ℃保存的IL - 2 上清液和检测小鼠脾细胞,在96 孔培养板中,每孔加入IL - 2 上清液和反应细胞各100μl ,阴性对照组加100μlPRMI - 1640 培养液,各设4 个平行样。置37 ℃,5 %CO2 饱和湿度培养48h ,每孔加入MTT(5mg/ ml) 10μl ,继续培养4h ,弃上清,加入酸化异丙醇100μl ,充分振荡后静置20min ,全自动酶标仪MTT法比色分析法测定IL - 2 活性(OD 值) 。

　　2 　实验结果

　　人参皂甙Rh2 注射液对小鼠免疫功能的影响(见表1 - 4)

　　表1 　人参皂甙Rh2 注射液对荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

　　分　组 剂量 动物数 吞噬百分率( %)

　　(mg/ kg) (.x ±SD)

　　对照组- 10 33. 2 ±3. 01 41. 7 ±3. 47

　　H22 10 25. 70 ±4. 59Δ 37. 7 ±5. 40

　　H22 + CP 20 10 22. 3 ±3. 80ΔΔ 31. 4 ±6. 60ΔΔ

　　H22 + Rh2 40 10 43. 1 ±4. 53 3 3 67. 0 ±4. 67 3 3 3

　　H22 + Rh2 20 10 40. 6 ±2. 59 3 3 62. 2 ±5. 65 3 3 3

　　H22 + Rh2 10 10 38. 7 ±3. 27 3 58. 4 ±2. 68 3 3 3

　　H22Rh2 各剂量组与H22组比较有明显差异, 3 :P < 0. 05 ; 3 3 :P < 0. 01 ; 3 3 3 :P < 0. 001 ;H22和H22CP 组与正常对照组比

　　较显著降低,Δ:P < 0. 05 ;ΔΔ:P < 0. 01。

　　表1 实验结果表明:人参皂甙Rh2 注射液各剂量组能明显提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能。环磷酰胺明显抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能。

　　表2 　人参皂甙Rh2 对荷瘤小鼠体液免疫的影响—血清溶血素抗体测定血凝法

　　分组 剂量(mg/ kg) 动物数抗体积数(.x ±SD)

　　对照组- 10 28. 4 ±6. 82

　　H22 - 10 20. 4 ±3. 89Δ

　　H22 + CP 20 10 12. 2 ±3. 12ΔΔΔ

　　H22 + Rh2 40 10 36. 6 ±4. 45 3 3 3

　　H22 + Rh2 20 10 35. 7 ±8. 27 3 3

　　H22 + Rh2 10 10 30. 4 ±3. 81 3

　　H22Rh2 注射液高、中剂量组和低剂量组与H22荷瘤对照组比较显著升高, 3 : P < 0. 05 ; 3 3 :P < 0. 01 ; 3 3 3 :P < 0. 001 ;

　　H22CP 组、H22与正常对照组比较有显著降低作用ΔΔΔ:P < 0. 001 ;Δ:P < 0. 05。

　　表2 实验结果表明:人参皂甙Rh2 注射液各剂量组抗体数明显高于对照组和CP 组,说明人参皂甙Rh2 注射液组有明显促进荷瘤小鼠体液免疫功能的作用,而环磷酰胺组则明显抑制

　　体液免疫功能的作用。

　　表3 　人参皂甙Rh2 注射液对荷瘤H22小鼠NK细胞活性的影响

　　分　组 剂量 动物数 LDU( IU) 细胞毒指数( %)

　　(mg/ kg) (.x ±SD)

　　对照组- 10 11. 59 ±1. 11 46. 62 ±7. 13

　　H22 - 10 8. 27 ±1. 63 24. 70 ±10. 69ΔΔ

　　H22 + CP 20 10 8. 43 ±0. 83 25. 63 ±6. 69ΔΔ

　　H22 + Rh2 40 10 10. 95 ±0. 93 3 40. 12 ±10. 73 3 3

　　H22 + Rh2 20 10 10. 32 ±1. 73 3 38. 94 ±11. 06 3

　　H22 + Rh2 10 10 9. 84 ±1. 65 3 33. 85 ±11. 92

　　人参皂甙Rh2 注射液各剂量组与荷瘤H22组比较, 3 3 :P < 0. 01 ; 3 :P < 0. 05 ;H22和H22 + CP 与正常对照组比较细胞毒指数显著降低,ΔΔ:P < 0. 01。

　　表3 实验结果表明:人参皂甙Rh2 注射液高、中剂量组与荷瘤组比较NK细胞杀伤活性明显增强,人参皂甙Rh2 注射液高剂量组IL - 2 活性显著高于荷瘤组。

　　表4 　人参皂甙Rh2 注射液对荷瘤小鼠脾细胞IL - 2 活性的影响

　　分　组 剂量(mg/ kg) 动物数 IL - 2 活性(OD 值)

　　(.x ±SD)

　　对照组- 10 　　　 　0. 134 ±0. 021

　　H22 - 10 　　　　 0. 075 ±0. 029Δ

　　H22 + CP 20 10 　　　　0. 060 ±0. 017Δ

　　H22 + Rh2 40 10 　　　　0. 123 ±0. 032 3

　　H22 + Rh2 20 10 　　　　0. 089 ±0. 019

　　H22 + Rh2 10 10 　　　　0. 070 ±0. 022

　　H22Rh2 注射液高剂量与荷瘤H22组比较, 3 :P < 0. 05。H22和H22 + CP 与正常对照组比较,Δ:P < 0. 05。

　　表4 实验结果表明:人参皂甙Rh2 注射液高剂量组IL - 2 活性显著高于荷瘤组。

　　3 　讨论

　　人参皂甙Rh2 是从人参中提取的单体皂甙成分之一。本研究进一步探讨人参皂甙Rh2 对荷瘤小鼠免疫功能的影响,结果表明:人参皂甙Rh2 注射液能提高荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞的吞

　　噬功能和促进荷瘤小鼠血清中羊红血球抗体生成。NK细胞是细胞免疫中非特异部分,很多研究发现H22荷瘤机体NK细胞活性明显降低[4 ] ,本实验也得到同样的结果。即荷肝癌(H22) 模型组小鼠的NK细胞活性处于严重低下状态,而人参皂甙Rh2 注射液高、中剂量组与荷瘤组比较NK细胞杀伤活性有明显增强。IL - 2 主要是由活化的辅助性T 淋巴细胞产生的细胞因子,IL - 2 具有自身正向免疫调节作用,但在大多数荷瘤机体, IL - 2 系统处于明显的抑制或紊乱,

　　荷瘤小鼠的IL - 2 活性低于正常组,而人参皂甙Rh2 注射液高剂量组显著提高IL - 2 活性。人

　　参皂甙Rh2 注射液通过调节和增强机体免疫功能,发挥其抗肿瘤作用。

　　参考文献:

　　[1 ] 王本祥. 人参研究[M] . 天津:天津科学技术出版社,1985. 223 - 227.

　　[2 ] 杨贵贞. 免疫生物工程纲要与技术[M]长春:吉林科学技术出版社,1991. 48.

　　[3 ] 周道洪,沈元珊,赵曼瑞. 测定淋巴细胞转化和鼠白细胞介素2 活性的新方法- MTT比色分析法[J ] . 中国

　　免疫学杂志,1986 ,2(1) :39.

　　[4 ] 彭贵勇,袁爱力,蔡景修. 荷瘤小鼠脾细胞淋转NK和LAK活性[J ] . 上海免疫学杂志,1994 ,14(4) :196