人参皂苷Rh2对人肝癌细胞SMMC一7721信号传导的影响

　　人参具有抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、增强免疫力等多种生物学活性。人参皂苷是人参中主要的活性有效成分。我们曾发现人参总皂苷在体外能诱导人肝癌细胞株HepG2分化，最近又发现人参皂苷单体Rh2(G—Rh2)一对人肝癌细胞株SMMC一7721有诱导分化作用。G一Rh2诱导SMMC一7721细胞分化过程中，癌细胞的信号传导系统必然会发生改变。通过研究G一Rh2对糖皮质激素受体(GR)、受体型酪氨酸激酶一胰岛素样生长因子I受体(IGFIR)Ca²+ 及蛋白激酶C(PKC)的影响, 并观察糖皮质激素拮抗剂一RU486对细胞生长、(PKC)、IGFIR及细胞周期调节因子的影响, 试图从信号传导方面初步探讨人参皂苷诱导分化作用机制。

　　一、材料与方法

　　1、材料：SMMC一7721人肝癌细胞株引自重庆大学生物工程系;G一Rh2由白求恩医科大学有机化学教研室提供，纯度>95%;小鼠抗人cyclin D1、小鼠抗人p16单克隆抗体，兔抗人cyclinE、兔抗人PKCα、兔抗人IGFIRβ多克隆抗体购自美国Santa公司;FITC标记山羊抗小鼠IgG、FITC标记山羊抗兔IgG购自北京中山生物技术有限公司;Fura一2AM、四甲基偶氮哇盐(MTT)、RU486为美国Sigma公司产品;RNA提取试剂为德国Boehringen Mannheim公司产品;逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)

　　试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

　　2、SMMC一7721细胞内游离Ca²+的测定：20ug/ml G一Rh2作用细胞0、1、3、5、24h后分别离心收集细胞, 荧光剂Fura一2AM负载细胞, 用荧光分光光度计在选定的激发和发射波长下, 测定各组细胞悬液的荧光强度值, 计算细胞内游离Ca²+。

　　3、检测SMMC一7721细胞PKCα和IGFIR β蛋白表达：20ug/mlG—Rh2处理细胞0、24、48、72h后, 用流式细胞仪检测膜型PKCα和IGFβ蛋白的表达。参照Yano等检测细胞内蛋白质的方法。

　　4、检测SMMC—7721洗白GR mRNA表达：20ug/mlG—Rh2处理细胞0、12、24、72h后，参照Tripure tm提取试剂说明书提取各组细胞总RNA，用RT—PCR法检测各组细胞GR mRNA表达水平。GR引物序列为?5′—ATGAGACCAGATGTAAGDTC—3′(正义);5′—AATGCCATAAGAAACATCCA—3′(反义)。β—actin引物序列为：5′—ACACTGTGCCCATCTACGAGG—3′(正义);5′—AGGGGCCGGACTCGTCATACT—3′(反义)。PCR扩增条件：94℃ 5min;94℃ 1min，60℃ 30s，72℃ 1min，30个循环;72℃延伸10min。

　　5、RU486对人参皂苷Rh2诱导SMMC—7721肝癌细胞分化的影响：分别用20ug/ml G—Rh2,5ug/ml RU486和5ug/ml RU486+20ug/ml G—Rh2处理细胞2d、4d和6d后，MTT检测RU486对肝癌细胞增殖的影响, 设有对照组和空白试剂组：20ug/ml G—Rh2和5 ug/ml RU486+20 ug/ml G—Rh2处理细胞72h后，流式细胞仪检测RU486对肝癌细胞周期调节因子、RKCα和IGFRβ蛋白表达的影响。

　　6、统计学处理：两样本率比较用u检验;两均数比较比较用t检验。

　　二、结果

　　1、G-Rh2对细胞内Ca²+的影响：SMMC—7721细胞经20ug/ml G—Rh2作用1h，细胞内Ca²+下降，随后升高，但始终低于对照细胞Ca²+处理0、1、3、5、24h时，说明G—Rh2能降低细胞内Ca²+，并在1h达到峰谷值。

　　2.G一Rh2对细胞PKCα和IGF I R β蛋白表达的影响:20ug/ml G—Rh2作用于SMMC一7721细胞24h后, 胞浆型PKCα和IGF I R β蛋白表达量显著降低, 并且随作用时间延长变化更加明显;膜型PKC α蛋白表达量很低，20 ug/ml G—Rh2作用后无显著性变化;见表1。表明G一Rh2能抑制SMMC一7721细胞胞浆型PKC α与IGF I R β蛋白表达，对膜型PKCα蛋白表达无影响。

　　3.G—Rh2对SMMC—7721细胞GR mRNA表达水平的影响如图所示, 电泳图谱显示两条泳带， 一条为内参照基因β一actin的扩增产物, 片段长度为621bp(第2、4、6、8泳道)另一条为目的基因GR的扩增产物， 片段长度为588bp(第1、3、5、7泳道)。可见对照细胞表达GR mRNA较少，细胞经20ug/ml G一Rh2处理12h后，细胞内表达量有所增加，并且随作用时间延长，G一Rh2促进GR ，mRNA表达的作用更加明显。结果表明G一Rh2能诱导细胞内GR mRNA表达。

　　4、RU486对G一Rh2诱导分化作用的影响：

　　(1)RU486对SMMC一7721细胞增殖的影响，见表2;5ug/ml RU486和空白试剂对SMMC一7721细胞增殖无影响, 20 ug/ml G一Rh2可以明显抑制细胞生长;但5 ug/mlRU486和20 ug/ml G—Rh2联合作用时，细胞生长并未受到抑制。提示RU486能拮抗G一Rh2对一细胞增殖的抑制作用。

　　(2)RU486对SMMC一7721细胞周期调节因子、PKCα和IGF IRβ的影响：细胞周期调节因子蛋白表达量用荧光强度指数(FI)表示。20 ug/mlG—Rh2能诱导周期负调节因子pl6蛋白表达，抑制周期正调节因子cyclinDl和cyclinE、胞浆型PKCα和IGF IRβ蛋白表达，对膜型PKCα无明显影响。但5 ug/ml RU486和20 ug/mlG一Rh2联合作用时，细胞没有出现G一Rh2诱导的上述蛋白变化(表3)。提示RU486可以阻断G一Rh2加发挥诱导分化作用。

　　二、讨论

　　Kin等研究了人参皂苷Rh2和Rh3诱导HL一60细胞向粒系分化过程中PKC异构体的调控作用，发现PKC活性降低。本研究结果提示G一Rh2可能通过降低细胞内Ca²+来抑制PKCα的转位和激活, 并通过抑制细胞内PKCα蛋白表达, 最终阻碍PKCα介导的增殖信号传导过程。对于许多恶性肿瘤细胞而言，外源性和自分泌性IGFs是很强的丝裂原，IGFs及IR介导的信号传导不仅可以促使恶性肿瘤细胞的增殖，同时还在细胞的转化、肿瘤发生发展过程中起关键作用。本结果提示肝癌细胞有高表达的IGFIR;G一Rh2可能通过降低肝癌细胞IGFIR表达来阻断IGFIR：G一Rh2工增殖信号传导通路而抑制肝癌细胞增殖和诱导其分化。由于G一Rh2在分子结构上和糖皮质激素(GH)非常相似，所以推测G一Rh2是通过结合细胞核内GR发挥诱导分化作用的。RU486是GH拮抗剂，与GR有较GH更强的亲和性。本研究结果提示G一Rh2作为细胞外一种亲脂性信号分子, 进入胞内后与胞核中的GR核受体结合，可能通过抑制肝癌细胞PKCα和IGIRβ表达来阻碍PKCα和IGFs一IGFIR介导的增殖信号传导通路, 从而抑制细胞的生长和诱导其分化。G一Rh2比可能是通过和GR结合而发挥诱导肝癌细胞分化作用的，在此过程中G一Rh2阻断Ca²+一PKC和IGFIRβ介导的增殖信号传导通路可能起了重要作用。